Using of modern molecular methods for isolation and identification of ligninolytic enzymes

Martin Řiháček

Bakalářská práce

Izolace a identifikace ligninolytických enzymů pomocí moderních molekulárních metod

Anotace:

Ligninolytické enzymy jsou schopné degradovat strukturu ligninu. Tohoto efektu se dá využít v různých průmyslech (potravinářský průmysl, textilní průmysl, zemědělství atd.), protože to může nahradit obvyklé chemické procesy. Houba bílé hniloby Phanerochaete chryosporium je známa produkcí těchto enzymů. Bakalářská práce pojednává o identifikaci a charakterizaci chování enzymů lignin peroxidázy, lakázy, mangan peroxidázy produkované touto houbou rostoucí v kapalném médiu při různých koncentracích síranu měďnatého (0, 0.1, 0.5 a 1 mM). Pro izolaci DNA a RNA bylo použito kapalné medium PDB, ve kterém houba rostla po dobu 5 dnů. Pro experimentálcí část byla použita běžná polymerázová řetězová reakce (PCR), reverzně transkripční PCR a kvantitativní rea-time PCR. Amplifikované produkty po běžné PCR byly očištěny a odeslány na sekvenování, aby se potvrdilo, jak se různé isoformy těchto enzymů vyvíjí při stresových podmínkách způsobené přídavkem síranu měďnatého o různých koncentracích. Navíc byla ještě měřena enzymatická aktivita těchto enzymů po dobu 32 dnů.1 mM koncentrace síranu měďnatého v kapalném médiu ovlivnila transkripci genů, kódující ligninolytické enzymy, produkcí jejich isoforem. Kromě toho, byla při této koncentraci také pozorována vyšší genová exprese těchto 3 genů: lakáza, mangan peroxidáza a lignin peroxidáza při srovnání s kontrolními vzorky. Na druhou stranu, nejlepší podmínky pro produkci těchto enzymů byly pozorovány pro lignin peroxidázu a mangan peroidázu při koncentraci 0.5 mM a pro lakázu 1 mM CuSO4. Proto jsme schopni říct, že produkce těchto enzymů houbou Phanerochaete chrysosporium je ovlivněna vysokou koncentrací měďnatých iontů.

Abstract:

Ligninolytic enzymes are able to decay the structure of lignin. This effect can be useful in the industry (food industry, textile industry, farming, etc) because it can replace regular chemical processes. The white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium is known for the production of these enzymes. This bachelor thesis deals with the identification and characterization of the behavior of enzymes such as lignin peroxidase, laccase and manganese peroxidase under different concentrations of copper sulfate (0, 0.1, 0.5 and 1 mM). For isolation of DNA and RNA, the fungi were grown in potato dextrose broth (PDB) during 5 days. Common PCR, reverse transcription PCR and quantitative real-time PCR were chosen for this experimental part. The PCR products were purified and sent to sequencing to confirm how their different isoforms develop under stress conditions of different concentrations of copper sulfate. Moreover, the enzymatic activity assay for the enzymes was done also under different copper sulfate environment for the experimental part.1 mM of copper sulfate concentration influenced the transcription of the enzymatic genes resulting in the production of their isoforms. It was also observed at the level of the gene expression, with a higher expression of these 3 genes; laccase, manganese peroxidase and lignin peroxidase, compared with the control samples. On the other hand, the best conditions for carrying out their enzymatic activities were observed at 0.5 mM concentration of CuSO4 for lignin peroxidase and manganese peroxidase and 1 mM in the case of laccase. After the molecular characterization, we can conclude that production of the enzymes of Phanerochaete chrysosporium are affected by high copper concentrations.

Klíčová slova

Houba bílé hniloby Phanerochaete chrysosporium, ligninolytické enzymy, enzymatická aktivita, lignin peroxidáza, lakáza, mangan peroxidáza

Keywords

White-rot fungus Phanerochaete chrysosporium, lignin peroxidase, laccase, manganese peroxidase, ligninolytic enzymes, enzymatic activity

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 1. 4. 2018

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Mgr. Stanislava Voběrková, Ph.D.

Mendelova univerzita v Brně

Agronomická fakulta

Bakalářský studijní program / obor:
Agrobiologie / Molekulární biologie a biotechnologie