Kontrola kvality kódujících a nekódujících RNA v lidských buňkách

Mgr. Dagmar Zigáčková, Ph.D.

Doctoral thesis

RNA surveillance of coding and noncoding RNAs in human cells

Abstract:

Jedním ze základních životních procesů je transkripce DNA do RNA, která umožňuje přenos a využití genetické informace. Transkripce je velmi dynamický a komplexní proces zahrnující množství molekulárních strojů z proteinů a RNA. Protože jsou molekuly RNA nejprve produkovány jako nezralé prekurzory, každá RNA musí podstoupit složité zpracování, aby dosáhla zralosti a tedy plné funkčnosti. Je nevyhnutelné, že při tak velkém množství probíhající transkripce a následném zpracování RNA částečně dochází i k vytvoření chybných RNA. Tyto potenciálně škodlivé transkripty musí být rychle rozpoznány a odstraněny, aby se zachovala rovnováha a správné fungování buňky. Všechny kroky tvorby zralé RNA podstupují kontrolu kvality, která zajišťuje degradaci vadných transkriptů. Ve své disertační práci uvádím přehled hlavních mechanismů kontroly kvality RNA u různých druhů organismů. Hlavním zaměřením této práce je několik aspektů kontroly kvality a odstranění kódujících a nekódujících RNA v lidských buňkách, převážně degradační dráhy TUT-DIS3L2 surveillance (TDS) a Staufen-mediated decay (SMD). Účastnila jsem se studie určení substrátu pro dráhu TDS, která byla nedávno popsána jako mechanismus kontroly kvality zprostředkovaný uridylací RNA. Prokázali jsme, že TDS přednostně zpracovává strukturované chybné nekódující RNA a fragmenty mRNA. Prezentuji zde také naši následnou studii o mechanismu a dynamice uridylace RNA, které jsou degradovány pomocí TDS. Dále jsem spolupracovala na projektu zaměřujícím se na strukturní podstatu rozpoznání dvouřetězcové RNA v mRNA proteinem Staufen1, který spouští degradační dráhu SMD. Vyřešení struktury ukázalo interakce mezi RNA-vazebnými doménami 3 a 4 proteinu Staufen1 a dvouřetězcovou RNA. Pomocí in vitro a in vivo experimentů bylo potvrzeno, že tyto interakce mají zásadní vliv na rozpoznání substrátu pro SMD. Nakonec prezentuji také detailní protokol pro purifikaci a testování aktivity dalšího faktoru kvality kontroly, TRAMP komplexu.

Abstract:

One of the fundamental processes of life is the transcription of DNA to RNA enabling the transmission and usage of genetic information. Transcription is a highly dynamic and complex process involving multiple protein and RNA machineries. As RNAs are first produced as immature precursors, each RNA transcript has to undergo elaborate biogenesis in order to reach its maturity and thus full functionality. Inevitably, because of the robustness of RNA transcription and processing, a fraction of defective RNAs is also produced. These potentially harmful transcripts have to be promptly recognized and eliminated in order to sustain the homeostasis and proper function of the cell. Therefore, all steps of RNA biogenesis are subjected to quality control, which ensures the degradation of aberrant transcripts. In this Ph.D. thesis I am providing an overview of main quality control pathways in diverse species. The major focus of this thesis is on several aspects of the surveillance and decay of coding and non-coding RNAs in human cells, mainly on the TUT-DIS3L2 surveillance (TDS) and Staufen-mediated decay (SMD). I was involved in the identification of the substrate repertoire of TDS, which is a recently established uridylation-mediated QC control pathway. We have demonstrated that TDS targets preferentially structured aberrant non-coding RNAs and 5' fragments of mRNAs. Also, I am presenting our subsequent study of the mechanism of TDS-targets uridylation and its dynamics. Further, I participated in a collaborative project focused on the structural basis of the recognition of dsRNA structure in mRNA by protein Staufen1, which is known to trigger SMD. The structure solution revealed interactions between Staufen1 RNA-binding domains 3 and 4 and the dsRNA. These interactions were confirmed by in vitro and in vivo experiments to be decisive for SMD targets recognition. Finally, I am also presenting a detailed protocol of purification and activity testing of another quality control factor, the TRAMP complex.

Keywords

RNA quality control, RNA surveillance, DIS3L2, uridylation, U-tail, non-canonical adenylation, TUTases, TDS, TSSas, 5'mRF, RNA degradation, RNA exosome, STAUFEN1, SMD

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 11. 2019

Thesis defence

• Date of defence: 28. 11. 2019
• Supervisor: doc. Mgr. Štěpánka Vaňáčová, Ph.D.
• Reader: Dr. Dominique Gagliardi, doc. Mgr. David Staněk, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biomolecular chemistry and bioinformatics / Biomolecular chemistry and bioinformatics