Charakterizace derivátů kyseliny hyaluronové

Ing. Bc. Matěj ŠIMEK

Doctoral thesis

Characterization of hyaluronic acid derivatives

Abstract:

Disertační práce se zabývá využitím technik hmotnostní spektrometrie a kapalinové chromatografie pro strukturní charakterizaci chemicky modifikovaného hyaluronanu (HA), a ke studium absorpce, distribuce a metabolismu nativního nebo chemicky modifikovaného HA. Teoretická část disertační práce je věnována analytickým postupům, metodám kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie včetně metod iontové mobility a zobrazovacích metod hmotnostní spektrometrie používaných pro analýzu HA a jiných glykosaminoglykanů. První část výzkumné práce byla věnována vývoji metody pro charakterizaci homogenity distribuce chemických modifikací podél řetězce lauroyl-modifikovaného HA. Byla vyvinuta metoda enzymatické degradace derivátu, při níž vznikají modifikované a nemodifikované oligosacharidy HA. Pomocí separace na reverzních fázích a hmotnostně spektrometrické detekce bylo možné vznikající nemodifikované oligosacharidy kvantifikovat. Množství a délka vzniklých oligosacharidů jsou závislé na stupni substituce a homogenitě distribuce substituentů. Pomocí této metody je možné odhalit nestandardně připravené deriváty, které v běžně měřených parametrech, jako je stupeň substituce a molekulová hmotnost, odpovídají specifikaci, avšak jejich fyzikálně chemické vlastnosti, jako nasákavost vody, jsou v důsledku nestandardní distribuce modifikací odlišné. Druhá část výzkumu byla zaměřena na vývoj analytické metody pro studium farmakokinetiky polymerní micely z oleyl-modifikovaného HA nesoucí cytostatikum doxorubicin. Vyvinutá metoda umožňuje stanovit farmakokinetiku léčiva i chemicky modifikovaného HA, který tvoří vlastní polymerní nosič. Rozdílná orgánová distribuce doxorubicinu a oleyl-modifikovaného HA ukázala, že polymerní micely nesoucí léčivo byly po intravenózní aplikaci rychle disociovány. S využitím technik gelové permeační chromatografie, chromatografické separace na reverzních fázích a hmotnostní spektrometrie bylo možné popsat změny v molekulové hmotnosti oleyl-modifikovaného hyaluronanu, ke kterým docházelo v rámci jeho metabolizace. Poslední část je věnována studiu absorpce, distribuce a metabolismu exogenního HA podávaného intravenózně a orálně. V literatuře existují nekonzistentní informace týkající se jeho osudu v biologickém systému. Výsledky jsou často zkreslené špatnou kvalitou HA a nedostatky fluorescenčního a radioisotopového značení, jež jsou využívány pro odlišení exogenního/endogenního HA. V rámci této práce bylo využito čistého biotechnologicky připraveného HA, značení stabilním isotopem 13C a analýzy pomocí kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie. Metoda umožnila jednoznačně určit vliv molekulové hmotnosti na osud intravenózně aplikovaného HA. HA s nízkou molekulovou hmotností byl rychle vyloučen ve formě malých fragmentů HA v moči, zatímco HA s vysokou molekulovou hmotností vykazoval saturovatelnou kinetiku a úplnou metabolizaci během 48 hodin od podání. Stejná metoda byla využita pro studium perorálně podaného HA. Zde bylo pomocí několika in vivo a in vitro studií prokázáno, že pro absorpci vysokomolekulárního HA je nutná jeho metabolizace střevním mikrobiomem. Pomocí plynové a kapalinové chromatografie s hmotnostně spektrometrickou detekcí bylo zjištěno, že produkty mikrobiální degradace HA jsou nenasycené oligosacharidy, aktivované cukry a krátké mastné kyseliny. Vysoká specificita metod kombinující enzymatickou degradaci a chromatografickou analýzu s hmotnostně-spektrometrickou detekcí umožnila jednoznačně určit farmakokinetiku oley-modifikovaného HA, závislost eliminační účinnosti na molekulové hmotnosti HA a popsat osud HA v organismu po jeho požití. Uvedené analytické postupy se mohou uplatnit nejen při studiu farm

Abstract:

akokinetiky a metabolizace chemicky modifikovaného HA, ale i jiných glykosaminoglykanů. Případně mohou posloužit při optimalizaci fermentačních procesů při biotechnologické výrobě HA.

Abstract:

This work deals with the use of mass spectrometry and liquid chromatography for the structural characterization of chemically modified hyaluronic acid (HA), and for the study of absorption, distribution and metabolism of native or chemically modified HA. The theoretical part is devoted to analytical procedures, chromatographic and mass spectrometric methods, including techniques of ion mobility and mass spectrometry imaging used for the analysis of HA and other glycosaminoglycans. The first research part deals with the method development of characterization the homogeneity of chemical modification along the polymer chain of lauroyl-modified HA. An enzymatic degradation was employed to obtain mixture of native and modified oligosaccharides. The unmodified oligosaccharides were analysed by reversed phase chromatography with mass spectrometric detection. The amount and length of formed oligosaccharides depended on the degree of substitution and the homogeneity of the substituent distribution along the polymer chain. The method was used for the identification of non-standardly prepared derivatives, which met the specification in the terms of degree of substitution and molecular weight, but hygroscopic properties were different due to the non-standard distribution of chain modifications. The second part of the work is focused on the study of the pharmacokinetics of polymeric micelles from oleyl-modified HA carrying the cytostatic doxorubicin. The unique procedure of preparation of biological samples enables to observe the pharmacokinetics of the drug and chemically modified HA. The different organ distribution of doxorubicin and oleyl-modified HA showed that the drug-bearing polymer micelles were rapidly dissociated after intravenous administration. Using gel permeation chromatography, reverse phase chromatographic separation, and mass spectrometry, it was also possible to describe the changes in the molecular weight of the oleyl-modified HA that occurred during its metabolism. The last part is devoted to the study of the absorption, distribution, and metabolism of exogenous HA, administered intravenously and orally. So far, there is inconsistent information regarding the fate of exogenously given HA. The data are often biased by the poor quality of HA and non-ideal labelling strategies used for resolving exogenous/endogenous HA, which only monitor the label and not HA itself. To overcome these drawbacks and establish the pharmacokinetics of intravenous HA in relation to its Mw, 13C-labelled HA in combination with above mentioned method of HA quantification allowed us to show that the elimination efficiency increased with decreasing Mw. Low Mw HA was rapidly eliminated as small HA fragments in urine, while high Mw HA exhibited saturable kinetics and complete metabolization within 48 h. The same methodology was used to study orally administered HA. These in vivo and in vitro studies have shown that the presence of the intestinal microbiome is important for absorption of oral high molecular weight HA. Additionally, novel method of HA oligosaccharide analysis, and metabolomics analysis enabled to identify unsaturated oligosaccharides, activated sugars and short fatty acids as the products of HA degradation by intestinal microbiome. Developed methods combining enzymatic degradation and chromatographic analysis with mass spectrometric detection conclusively determine the pharmacokinetics of oleyl-modified HA, the dependence of elimination efficiency on the molecular weight of HA and describe the fate of HA in the body after its ingestion. These analytical procedures can be used not only to study the pharmacokinetics and metabolism of chemically modified HA, but also other glycosaminoglycans. Alternatively, they can be used to optimize fermentation processes in the biotechnological production of HA.

Keywords

Hyaluronan, hmotnostní spektromerie, deriváty, metabolismus, farmakokinetika

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 29. 9. 2021

Thesis defence

• Supervisor: prof. RNDr. Karel Lemr, Ph.D., prof. RNDr. Karel Lemr, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Chemistry / Analytical Chemistry