Využití metody real-time PCR v širokospektré detekci patogenů

Mgr. Eva Němcová, Ph.D.

Doctoral thesis

Application of real-time PCR in broad-range pathogen detection

Abstract:

Metoda PCR je stále více využívána v molekulární detekci patogenů. Jejími výhodami jsou rychlost, citlivost a možnost diagnostikovat agens i v případě jeho obtížné kultivovatelnosti nebo z klinických vzorků odebraných pod antibiotickou clonou. Aplikace real-time PCR znamená nižší riziko kontaminace a přináší možnost kvantifikovat mikrobiální nálož ve vyšetřovaném vzorku. Cílem disertační práce byla optimalizace této metody pro detekci a identifikaci hub (kandid) a širokospektrou detekci a identifikaci bakterií. Za tímto účelem byla pro detekci a identifikaci kandid vyvinuta metoda real-time PCR cílená do oblasti ITS2 s následnou analýzou tání s vysokým rozlišením (HRMA), testována byla na 25 sbírkových kmenech a 143 klinických izolátech. Při zahrnutí všech sbírkových a klinických kmenů bylo pomocí real-time PCR a HRMA odlišeno 23 z 27 druhů kandid a zbylé 4 druhy byly rozděleny do dvou skupin. Pro detekci bakterií byla vyvinuta metoda real-time PCR cílená do oblastí V3 a V4 genu 16S rRNA s následnou sekvenační analýzou. Metoda byla testována na 21 sbírkových kmenech a 28 chlopních od pacientů s infekční endokarditidou a 20 chlopních od pacientů s neinfekční diagnózou. Výhodou real-time PCR byla rychlejší detekce bakterií a přesnější dourčení streptokoků do druhu na srovnatelné senzitivitě a specificitě s širokospektrou end-point PCR.

Abstract:

PCR is being increasingly used in pathogen detection. It is fast, sensitive method capable to detect fastidious pathogens or those in samples taken under antibiotic treatment. Application of real-time PCR can lower the contamination risk and bring the opportunity to quantify the amount of pathogen in the sample. The aim of this study was to optimise this method for detection and identification of fungi (Candida sp.) and for broad-range detection and identification of bacteria. For this purpose real-time PCR targeted ITS2 region followed by High Resolution Melting Analysis (HRMA) was developed, tested on 25 reference Candida strains and 143 clinical isolates. Considering reference and clinical strains together, 23 out of 27 Candida species could be clearly distinguished by HRMA, while the remaining 4 species were ranged in 2 groups. Real-time PCR targeted V3 and V4 regions of 16S rRNA gene and followed by direct sequencing was developed for detection and identification of bacteria. The assay was tested on 21 reference bacterial strains and 28 heart valve tissue samples from patients with suspicion of infectious endocarditis (IE) and additional 20 heart valve tissue samples from patients not suffering from IE. Advantage of the real-time PCR compared to broad-range end-point PCR was faster bacteria detection and more accurate identification of streptococci into the species with comparable sensitivity and specificity of both methods.

Keywords

Candida sp., analýza tání s vysokým rozlišením (High Resolution Melting Analysis, HRMA), ITS2, širokospektrá detekce bakterií, real-time PCR, 16S rRNA, sekvenování

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 30. 12. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 29. 6. 2015
• Supervisor: prof. MUDr. Miroslav Votava, CSc., doc. MUDr. Tomáš Freiberger, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Medical Microbiology and Immunology (4-years) / Medical Microbiology and Immunology