Strukturní charakterizace rostlinných fotosyntetických superkomplexů

Mgr. Lukáš NOSEK

Doctoral thesis

Structural characterization of photosynthetic supercomplexes in plants

Abstract:

This thesis is aimed on the structural characterization of various plant photosynthetic complexes using a combination of CN-PAGE and single particle electron microscopy. Single particle electron microscopy is a powerful structural technique and provides ample structural information about a studied complex. In order to facilitate the structural characterization, optimization of a specimen preparation for electron microscopy is a very important step. The optimization is a complex process and comprises of several steps, as described in details in the chapter 3. Experimental approach. First of all, a proper plant material has to be selected. Then, conditions of a protein separation using CN-PAGE, including selection of a proper detergent and its concentration, are optimized. Final step involves extraction of separated protein complexes from the CN-PAGE gel and a preparation of specimen for electron microscopy. Once the workflow is optimized, it can be successfully applied in a structural study. The aim of my thesis was a structural characterization of three large protein assemblies involved in photosynthesis like the PSI-NDH supercomplex from barley, the PSII-LHCII supercomplex from Norway spruce and the PSII megacomplex from Arabidopsis thaliana. The first paper deals with the structural characterization of the PSI-NDH supercomplex isolated from barley (Hordeum vulgare). The structural analysis revealed that one NDH complex binds up to two PSI supercomplexes, which are to NDH bound at asymmetric positions. Moreover, positions of rare Lhca5 and Lhca6 antennas stabilizing the whole supercomplex were indicated. As we discovered both supercomplexes with one and two PSI bound to NDH, it implies that gradual formation and dissociation of the PSI-NDH supercomplex may function as a tuning of cyclic electron flow around PSI. The second paper describes the structural characterization of the PSII supercomplex isolated from Norway spruce (Picea abies). Spruce belongs to the group of gymnospermous plants (family Pinaceae) and we provided the first structural analysis of PSII supercomplex isolated from this plant group. Moreover, using an extensive genomic analysis we also discovered that the group of land plants including families Pinaceae and also Gnetales lack genes for Lhcb3 and Lhcb6 subunits, which has a noticeable impact on the structural organization of PSII supercomplexes. These two subunits have evolved during transition of plants from water to land and were considered to be characteristic for all land plants. Their absence in these plant groups breaks the current evolutionary dogma and modifies PSII supercomplex in such a way that it resembles PSII from evolutionary older organism, alga Chlamydomonas reinhardtii. The third paper structurally characterizes PSII megacomplexes isolated from Arabidopsis thaliana. These megacomplexes are formed of two PSII supercomplexes, which mutually interact in parallel and in non-parallel. The structural characterization of megacomplexes interacting in non-parallel was performed for the first time. The presence of both groups of megacomplexes was also detected on the level of native grana thylakoid membrane, which is an evidence of their nativity and thus a physiological significance.

Abstract:

Ve své dizertační práci jsem se věnoval optimalizaci izolace a strukturní charakterizaci rostlinných fotosyntetických superkomplexů pomocí transmisní elektronové mikroskopie, která ve spojení s obrazovou analýzou poskytuje strukturní informace o studovaném komplexu. Mezi hlavní studované objekty patřily superkomplexy fotosystému 1 (PSI) a fotosystému 2 (PSII). V obou případech se jedná o velké pigment-proteinové superkomplexy tvořené mnoha podjednotkami, jejichž hlavním úkolem je transformace absorbované světelné energie na energii chemickou. Tyto superkomplexy nejsou v rostlině přítomny volně, ale jsou vázané v thylakoidní membráně chloroplastů. Zmíněné superkomplexy mohou navíc asociovat s dalšími proteinovými komplexy thylakoidní membrány, případně i mezi sebou navzájem a vytvářet tak velké megakomplexy. Jedním z takových příkladů je tzv. PSI-NDH supercomplex, který představuje asociaci mezi PSI a NDH a jehož existence byla již dříve předpovězena na základě různých biochemických analýz. V disertační práci je detailně popsána jeho strukturní charakterizace pomocí elektronové mikroskopie. Důležitým krokem předcházejícím samotné strukturní charakterizaci byla optimalizace podmínek pro izolaci zmíněného komplexu v dostatečné kvantitě i kvalitě. Optimalizace zahrnovala volbu vhodného rostlinného materiálu, který obsahoval dostatečné množství PSI-NDH superkomplexu a dále také výběr vhodného detergentu, který by účinně a šetrně superkomplex z thylakoidních membrán solubilizoval. Solubilizované thylakoidní membrány z ječmene jarního byly poté separovány pomocí bezbarvé nativní polyakrylamidové gelové elektroforézy (CN-PAGE), optimalizované pro separaci vysokomolekulárních komplexů. Strukturní analýza izolovaného PSI-NDH superkomplexu odhalila prvotní informace o jeho specifické organizaci a schopnosti NDH komplexu vázat dva komplexy PSI. Během optimalizace izolačních podmínek za účelem zisku dostatečného množství PSI-NDH superkomplexu byly v CN-PAGE detekovány další proteinové pásy s komplexy o velmi vysoké molekulové hmotnosti. Následná strukturní analýza, která je v dizertační práci detailně popsána, ukázala, že zmíněný pás obsahoval několik typů megakomplexů tvořených dvěma PSII superkomplexy. Tyto megakomplexy tvořily dvě skupiny, ve kterých PSII superkomplexy interagovaly buď paralelně, nebo neparalelně. Megakomplexy s paralelně interagujícími fotosystémy byly objeveny již dříve, nicméně strukturní charakterizace megakomplexů s neparalelně interagujícími fotosystémy prezentovaná v dizertační práci byla provedena vůbec poprvé. Detekce PSII megakomplexů na úrovni izolované thylakoidní membrány indikuje jejich fyziologický význam a je předmětem dalšího výzkumu. Dalším studovaným objektem byl PSII superkomplex izolovaný ze smrku ztepilého. Smrk je zástupce nahosemenných rostlin, čeledi borovicovitých, a struktura prezentovaná v dizertační práci představuje úplně první strukturální studii PSII superkomplexu provedenou na zástupci zmíněné rostlinné skupiny. Strukturní analýza v kombinaci s genetickou analýzou vedla k nečekanému zjištění, že smrk a další zástupci čeledi borovicovitých jsou evolučně odchýleni od zbytku vyšších rostlin, což se projevilo i ve změně struktury PSII superkomplexu oproti ostatním zástupcům vyšších rostlin.

Keywords

CN-PAGE, Electron microscopy, Photosystem I, Photosystem II, PSI-NDH

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 8. 12. 2016

Thesis defence

• Supervisor: RNDr. Roman Kouřil, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Physics / Biophysics