Synthesis of immunofluoescent probes and affinity surfaces for selective and sensitive analysis of biologically important molecules

Mgr. Marcela Lišková, Ph.D.

Doctoral thesis

Anotácia:

V mnoha bioanalytických aplikacích jsou biologicky významné molekuly (DNA, proteiny a protilátky) konjugovány s fluorescenčními značkami pro dosažení vysoké citlivosti analýz. Polovodičové luminiscenční nanočástice, kvantové tečky, se ukázaly být vhodná součást luminiscenčních sond a senzorů s širokým využitím v analytické chemii. Kvantové tečky mají vysoký extinkční koeficient, široké excitační vlnové délky, velikostně laditelné emisní vlnové délky, úzká a symetrická emisní spektra, vysoké kvantové výtěžky, poměrně dlouhou na velikosti závislou luminiscenční dobu života a vysokou fotostabilitu. Díky těmto výhodným vlastnostem se kvantové tečky a jejich konjugáty staly alternativou k organickým fluoroforům v mnoha in vitro a in vivo bioaplikacích. Pro tyto účely bývají kvantové tečky kovalentně vázány s protilátkami, proteiny, peptidy, DNA či enzymy. Tyto konjugáty se připravují pomocí tzv. “cross-linkerů jako jsou např. 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) karbodiimid (EDC) a N-hydroxysulfosukcinimid. Kvantové tečky byly dále úspěšně použity v buněčném zobrazování, imunotestech nebo při DNA hybridizaci. Tyto vysoce stabilní polovodičové kvantové tečky našly široké použití jako složka nanosenzorů. Kvantové tečky se využívají jako fluorescenční donory v senzorech založených na Förstrově rezonančním přenosu energie (FRET) pro citlivou a selektivní analýzu mnoha biologicky významných procesech. Předložená práce uvádí přehled jednotlivých syntéz fluorescenčních značek, zvlástě pak kvantových teček teluridu kademnatého; luminiscenčních sond založených na kvantových tečkách, FRET senzorů s kvantovými tečkami jako donory energie a použití těchto luminiscenčních značek v bioapplikacích. Bioanalytické aplikace jsou prezentovány jako detekční metody kapilární elektroforézy a mikroskopické zobrazovací metody. Vysoká citlivost těchto metod umožňuje dokonce i analýzu chemického obsahu jedné buňky. V současné době se mnoho pozornosti věnuje analýze glykanů, jelikož glykosylace jsou nejčastěji vznikající post-translační modifikace proteinů a hrají významnou roli v živých organismech pro rozpoznávání buněk, jejich komunikaci nebo v rozpustnosti bílkovin. Glykany obvykle neobsahují molekuly chromoforů nebo fluoroforů. Pro jejich citlivou analýzu bývají derivatizovanány. Využívají se pozitivně i negativně nabité fluorescenční značky. Nejčastěji používané značky jsou aminonaftalentrisulfonát (ANTS) a aminopyrentrisulfonát (APTS). Glykany se obvykle analyzují pomocí hmotnostní spektrometrie (MS) v kombinaci s vysoko účinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) nebo kapilární elektroforézou (CE) jako separační metodou. Fluorescenční nabité značky podporují ionizaci v MS analýze. Byla navržena syntéza tří typů nových kladně nabitých fluorescenčních značek pro citlivou analýzu oligosacharidů a glykanů. Jako výchozí látka syntézy byla požita molekula APTS. V práci je dále popsána bioanalytická aplikace tří typů nových kladně nabitých fluorescenčních značek jako metoda značení oligosacharidů pro kombinaci CE s MS a LIF detekcí.

Abstract:

In many bioanalytical applications, biologically important molecules (DNA, proteins and antibodies) are conjugated with fluorescent labels to achieve a high sensitivity of analyses. Semiconductor nanoparticles, quantum dots, have proved to be suitable parts of highly luminescent probes and sensors with a broad usability in analytical chemistry. Quantum dots offer high extinction coefficients, with wide range of excitation wavelengths, size tunable emissions, narrow and symmetric emission spectra, high quantum yields, relatively long size dependent luminescence lifetime and practically no photobleaching. Thanks to these properties, quantum dots and their conjugates have become a suitable alternative to organic fluorophores for many in vitro and in vivo bioapplications. For these purposes, quantum dots are covalently bonded with antibodies, proteins, peptides, DNA or enzymes. Conjugates of QDs are prepared using so called “cross-linkers” such as 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and N-hydroxysulfosuccinimide. These semiconductor nanoparticles have been used successfully in cellular imaging, immunoassay, DNA hybridization etc. The highly stable semiconductor QDs have found wide usage as a component in nanoscale sensors. There is a high suitability to use QDs as fluorescent donors in a Förster resonance energy transfer (FRET) based sensors for sensitive study of many biologically important processes. The presented work submits an overview of syntheses of fluorescent tags, especially CdTe quantum dots; luminescence probes based on quantum dots, FRET sensors with QD as a donor of energy and usage of these luminescent labels in bioapplication. The bioanalytical applications are presented as detection methods of capillary electrophoresis and imaging microscopy methods. The high sensitivity of these methods allows even the analysis of the chemical content of single cells. Currently much attention is devoted to the analysis of glycans, since glycosylations are the most frequent post-translational modification of proteins and play an important role in living organisms for cell recognition and communication or solubility of proteins. Glycans usually do not have a naturally occurring chromophore or fluorophore. Therefore, they are derivatized for sensitive analysis. It is possible to use positively as well as negatively charged fluorescent labels. The most commonly used labels are negatively charged aminonaphtalenetrisulfonate (ANTS) and aminopyrenetrisulfonate (APTS). Glycans are generally analyzed by mass spectrometry (MS) in combination with high performance liquid chromatography (HPLC) or capillary electrophoresis (CE) as separation steps. The charged fluorescent labels support ionization in MS analysis. Syntheses of the three types of new multi-positively charged fluorescent labels for sensitive analysis of oligosaccharides and glycans were demonstrated. As a starting reagent for the synthesis, the APTS was used. This work presents bioanalytical application of the three types of new fluorescent labels as labeling method for oligosaccharides for CE with MS and LIF detection.

Keywords

quantum dot, conjugation, luminescent probe, Caspase-3, apoptosis, FRET sensor, fluorescent label

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 11. 5. 2016

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 28. 6. 2016
• Vedúci: doc. RNDr. Pavel Pazdera, CSc.
• Oponent: doc. RNDr. Petr Skládal, CSc., RNDr. Václav Kašička, CSc., doc. Ing. Jan Pospíchal, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Chemistry (4-years) / Organic Chemistry