Interakce vybraných komplexů přechodných kovů s biomakromolekulami.

Mgr. Tereza SUCHÁNKOVÁ

Doctoral thesis

INTERACTIONS OF SELECTED TRANSITION-METAL BASED COMPLEXES WITH BIOMACROMOLECULES

Abstract:

V buněčné DNA může docházet k chemické modifikaci bází způsobené jak různými vlivy životního prostředí, tak látkami, které vznikají při vnitrobuněčných procesech či chemoterapeutiky. Protinádorově účinné látky s centrálními atomy těžkých kovů, především sloučeniny platiny, patří v současnosti k nejvíce používaným v klinické praxi. Bylo mnohokrát experimentálně prokázáno, že úspěch léčiv na bázi platiny je založen na jejich schopnosti tvořit na DNA několik typů kovalentních aduktů, které zahrnují monofunkční adukty, vnitrořetězcové a meziřetězcové můstky. Modifikované báze DNA jsou potenciálně mutagenní a cytotoxické a v důsledku toho tak mohou vést k buněčné smrti. V buňkách se proto vyvinul komplexní systém oprav, který je využíván k odstranění poškození bazí a tím k zajištění integrity genomu. V rakovinných buňkách je ovšem oprava DNA modifikované léčivy nežádoucí a je právě jedním z mechanismů, díky kterému nádory získávají k léčbě rezistenci. V buňkách savců jsou poškození způsobená sloučeninami na bázi platiny odstraňována z DNA především pomocí tzv. nukleotidové excisní opravy (NER). Předkládaná disertační práce sestává ze dvou částí. První, experimentální část, se zaměřila na specifikaci podmínek pro studium nukleotidové excisní opravy v laboratorní praxi. Po optimalizaci byla metoda použita pro porovnání úrovně reparace poškození způsobených nově syntetizovanými protinádorově účinnými komplexy kovů. I když tato činidla tvoří na DNA různé typy poškození, k nejzávažnějším patří adukty spojující oba komplementární řetězce DNA ? meziřetězcové můstky. Pochopení mechanismu, jakým jsou tyto adukty v buňkách opravovány, je dlouhotrvajícím problémem, především kvůli velké variabilitě jejich strukturně-chemických vlastností. Doposud není jasné jak fyzikální a chemické vlastnosti jednotlivých můstků ovlivňují schopnost buňky odstranit takto komplexní typ poškození. Druhá část této práce se tedy zaměřila na studium strukturních vlastností meziřetězcových můstků pomocí počítačových simulací. Mechanismus nukleotidové excisní opravy zahrnuje rozpoznání místa poškození, rozvinutí DNA v tomto místě, vystřižení a odstranění úseku obsahujícího poškození a následně syntézu nového fragmentu DNA o délce cca 30 nukleotidů a jeho vložení do vzniklé mezery. Kruhová plazmidová DNA byla po inkubaci s různými protinádorově účinnými látkami studována v reakční směsi s buněčným extraktem, obsahujícím proteiny účastnící se opravy DNA, a s radioaktivně značenými deoxyribonukleotidy. Po gelové elektroforéze a autoradiografické kvantifikaci množství zainkorporované radioaktivity byla určena úroveň reparace aduktů jednotlivých látek. Všechny studované sloučeniny, zahrnující komplexy platiny s cis či trans geometrií a polynukleární komplexy nebo komplexy s centrálním atomem ruthenia, byly z DNA méně efektivně odstraňovány v porovnání s již dříve používanými léčivy, prokázaly tedy zvýšenou odolnost svých aduktů k reparačním procesům a tím vylepšenou protinádorovou aktivitu. Cílem druhé části disertační práce bylo prokázat, že techniky počítačových simulací mohou být užitečným doplňkem laboratorních experimentů a poskytnout další detailnější informace o interakci DNA s protinádorově účinnými látkami. Výsledky molekulárně dynamických simulací s použitím modelovacího balíku AMBER11 ukázaly, jak meziřetězcové můstky tvořené komplexy platiny stericky ovlivňují strukturu DNA a způsobují tak změny v ohybu a rozvinutí dvojité šroubovice.

Abstract:

Cellular DNA is sensitive to chemical modifications caused by various environmental agents, endogenous agents produced by cellular processes and chemoterapeutic agents. Metal-based coordination complexes, especially platinum compounds, represent an important class of anticancer agents that belong currently to the drugs most frequently used in the clinic. There is a large body of experimental evidence indicating that success of platinum complexes in treatment of tumor cells is based on their ability to damage DNA by forming several types of covalent adducts, such as monofunctional adducts, intrastrand or interstrand cross-links. DNA bases modified by metallodrugs are potentially mutagenic and cytotoxic and so can lead to the cell death. Cells have developed complex repair systems to remove these lesions and thus preserve the integrity of their genomes. However, in cancer cells, repair of the modification caused just by antitumor agents, is an undesired mechanism by which tumors can acquire resistance to anticancer drugs. Mammalian cells remove lesions, produced by platinum drugs, mainly by using the pathway known as nucleotide excision repair (NER). This thesis consists of two parts. Firstly, the experimental part has been focused on the development of specific conditions for in vitro NER assay. After that the level of DNA repair synthesis induced by various novel antitumor metal-based drugs was compared. Although these types of drugs form several types of DNA lesions, one of the most disruptive are interstrand cross-links. Understanding how interstrand cross-links are repaired has been a challenging problem because there is wide variation in chemical structures of these adducts. It is unclear how the physical and chemical properties of a given interstrand cross-link affect ability of the cell to repair such a complex form of DNA damage, so in the second part of this thesis, the molecular structures of these lesions were investigated by means of molecular dynamics simulations. The NER pathway involves damage recognition, unwinding of the DNA around the site of damage, incision on either side of the lesion, removal of a fragment containing lesion, and finally DNA synthesis and ligation to form a repair patch of cca 30 nucleotides. DNA repair synthesis was investigated by incubating circular plasmid DNA damaged by various antitumor compounds, with cell-free extracts containing DNA repair proteins in a reaction mixture which included radiolabeled deoxyribonucleotides. After gel electrophoresis and autoradiography the incorporation of radioactivity was quantified and used as a measure of the level of DNA repair. DNA damage by all studied compounds, including platinum complexes with cis/trans-geometry and polynuclear complexes or ruthenium complexes, was less efficiently removed from DNA than damage by conventional cisplatin. Thus, they exhibited enhanced resistivity against repair, which was one of important factors contributing to their activity in tumor cells. In the second part, it was shown that computational techniques, provide an useful complement to experiments and are often capable to give further specific information about the interactions of DNA with antitumor compounds. Molecular dynamics simulations, using molecular modeling software package AMBER11 have shown how interstrand crosslinks formed by platinum ligands affect structure of DNA duplex by formation of sterical clashes with DNA backbone and thus leading to change of the bend angle or unwinding of the double helix.

Keywords

protinádorově účinné látky, cisplatina, vazba na DNA, meziřetězcové můstky, molekulové modelování

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 31. 5. 2012

Accessible from:: 31. 5. 2012

Thesis defence

• Supervisor: Prof. RNDr. Jana Kašpárková, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Physics / Biophysics