Analýza chaperonového systému Hsp70/Hsp90 v nádorových buňkách

Mgr. Eva Růčková, Ph.D.

Doctoral thesis

Analysis of the Hsp70/Hsp90 chaperone system in cancer cells

Abstract:

Zvýšená aktivita chaperonového systému je charakteristickým znakem nádorových buněk, avšak způsob regulace jeho aktivity dosud není detailně objasněn. Činnost chaperonu Hsp90 je řízena mimo jiné interakcemi s ko-chaperony, a proto jsme u nádorových buněčných linií a u panelu kolorektálních nádorů stanovovali úroveň exprese Hsp70, Hsp90 a ko-chaperonů HOP a CHIP. Následně jsme analyzovali souvislost jejich exprese s aktivitou chaperonového systému. Z našich výsledků vyplývá, že exprese chaperonů Hsp70 a Hsp90 a ko-chaperonu HOP je, na rozdíl od ko-chaperonu CHIP, regulována obdobnými stimuly. Jejich exprese je po inhibici Hsp90 indukována transkripčním faktorem HSF1 a v neproliferujících buňkách je exprese těchto proteinů snížena. Transkripce ko-chaperonu CHIP je na HSF1 nezávislá a v nedělících se buňkách je jeho hladina stabilní nebo mírně zvýšená. U pacientů s kolorektálním karcinomem jsme pozorovali zkrácení mediánu přežití v případě vyšší exprese Hsp70 a vyššího poměru hladin ko-chaperonu HOP vůči ko-chaperonu CHIP. Souhrnně tato data dokreslují model aktivity ko-chaperonů, kdy CHIP zprostředkovává degradaci a HOP naopak podporuje stabilizaci klientských proteinů. V navazující práci jsme se zaměřili na analýzu fosforylace aminokyselin v blízkosti C-terminálního motivu EEVD chaperonů Hsp70 a Hsp90. Prokázali jsme regulační význam této fosforylace, neboť ko-chaperon CHIP interaguje s nefosforylovanými, zatímco HOP s fosforylovanými chaperony. Dále jsme ukázali, že v intenzivně proliferujících buňkách jsou chaperony fosforylovány ve větší míře a že tyto fosforylace přímo ovlivňují rychlost proliferace. Souhrnně naše výsledky ukazují, že v nádorových buňkách převládá aktivita podporující stabilizaci klientských proteinů, ke které přispívá jak zvýšená exprese Hsp70, Hsp90 a ko-chaperonu HOP, tak současné posttranslační modifikace chaperonů fosforylací.

Abstract:

Activation of the chaperone system is a characteristic of cancer cells, however the mechanism of such upregulation is not known yet. The regulation of chaperone activities involves their interactions with co-chaperones; therefore we investigated the expression of Hsp70, Hsp90 and their co-chaperones HOP and CHIP in cancer cell lines and primary cancers. We confirmed that transcription of Hsp70, Hsp90 and HOP is activated by HSF1 after Hsp90 inhibition, while we observed no response to this transcription factor in the case of CHIP. On the contrary non-proliferating cells expressed lower levels of Hsp70, Hsp90 and HOP and higher CHIP levels compared to proliferating cells. In a panel of colorectal cancer samples, increased expression of Hsp70 and an increased ratio of HOP to CHIP were associated with decreased median survival. These data are in keeping with proposed tumor suppressor properties of CHIP, while over-expression of HOP may contribute to enhanced Hsp90 activity and stabilization of client proteins in tumors. In further work we focused on the analysis of Hsp70 and Hsp90 C-terminal phosphorylations. We found that Hsp70 and Hsp90 phosphorylation prevents binding to CHIP and enhances binding to HOP. We also show that highly proliferative cells contain phosphorylated chaperones and that phosphorylation is directly associated with increased proliferation rate. Together our results demonstrate that cancer cells possess an elevated protein folding environment due to elevated Hsp70, Hsp90 and HOP expression and simultaneous chaperone modifications.

Keywords

Molekulární chaperon, ko-chaperon, Hsp90, Hsp70, HOP, CHIP, HSF1, posttranslační modifikace, fosforylace, nádorová buňka, nádorové onemocnění Molecular chaperone, co-chaperone, posttranslational modification, phosphorylation, cancer cell, cancer

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 30. 6. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 19. 9. 2014
• Supervisor: RNDr. Bořivoj Vojtěšek, DrSc.
• Reader: doc. RNDr. Miroslav Fojta, CSc., prof. Ing. Miroslav Strnad, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Molecular and Cellular Biology