Freezing-Induced Acidity Changes of Buffered Aqueous Solutions

Susrisweta Behera, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Zmrazování a lyofilizace vodných roztoků jsou techniky široce používané při výrobě biologických látek, které umožňují flexibilitu výroby a zvýšenou skladovatelnost materiálu. Kyselost je klíčovým faktorem pro stabilitu sloučenin jak v roztoku, tak v lyofilizovaných produktech. Nesčetněkrát bylo prokázáno, že silné odchylky od optimálního pH způsobují degradaci sloučeniny, např. agregaci proteinů. Farmaceutické formulace často obsahují pufry pro regulaci pH, ale tyto pufry mohou přestat fungovat ve zmrazených roztocích kvůli stresům vyvolaným mrazem, jako je frakční krystalizace složek, efekt zkoncentrování zamrazením nebo Workmanův-Reynoldův efekt. V mé dizertační práci byl zkoumán vliv zmrazování na kyselost pufrovaných vodných roztoků. Protože příčiny těchto účinků nebyly dříve plně pochopeny, provedli jsme podrobnou studii. Výsledky shrnuté v této práci byly buď publikovány, nebo budou předloženy k publikaci. Byly tak provedeny experimenty s dvanácti nejčastěji používanými biologickými pufry (včetně karboxylové kyseliny, aminokyselin, aminových, fosfátových a Goodových pufrů) a se čtyřmi roztoky cukrů (např. sacharidy, disacharidy a cukerné alkoholy). Široká škála experimentálních technik byla použita ke zkoumání změn kyselosti vyvolané mrazem a k pochopení základních příčin. Proces chlazení a zahřívání pufrovaných vodných roztoků byl sledován diferenciální skenovací kalorimetrií, optickou kryomikroskopií a UV-Vis spektroskopií. Kalorimetrické studie ukazují vitrifikaci a krystalizaci koncentrovaných roztoků v žilách. Výsledky optické kryomikroskopie ukázaly morfologické změny zmrazených vzorků. Změny kyselosti pufrovaných roztoků vyvolané zmrazením byly zkoumány pomocí UV-VIS absorpční spektroskopie s použitím sulfoneftaleinových barviv v roli acidobazických indikátorů. Práce také navrhuje řešení pro zmírnění změn kyselosti pufrovaných roztoků vyvolaných zmrazením (1) volbou určité koncentrace pufrů, (2) smícháním dvou pufrů vykazujících opačnou změnu kyselosti vyvolanou zmrazením a (3) přidáním vhodné koncentrace cukrů. Výsledky této práce mohou nabídnout nové možnosti pro zlepšení technik používaných při zmrazování a lyofilizaci.

Abstract:

Freezing and freeze-drying of aqueous solutions are the techniques vastly used in the production of biologics that enable manufacturing flexibility and increased shelf-life of the material. Acidity is the key factor for the stability of compounds both in solution and in lyophilized products. Strong deviations from the optimum pH have been shown countless times to cause the compound’s degradation, e.g., protein aggregation. Pharmaceutical formulations often incorporate buffers to regulate pH, but these buffers may cease working in frozen solutions due to freezing-induced stresses, such as the fractional crystallization of the components, the freeze-concentrate effect, and the Workman-Reynold effect. In my doctoral thesis, the influence of freezing on the acidity of buffered aqueous solutions has been investigated. As the causes of these effects have not been previously fully understood we have undertaken a detailed study. The results summarized in this thesis have either been published or will be submitted for publication. Hereby experiments with the 12 most frequently used biological buffers (including carboxylic acid, amino acids, amine, phosphate, and Good’s buffers) and 4 sugars (e.g., saccharides, disaccharides, and sugar alcohols) solutions were conducted. A broad range of experimental techniques were utilized to investigate freezing-induced acidity change and to arrive at an understanding of the underlying causes. The cooling and heating process of buffered aqueous solutions was observed by differential scanning calorimetry, optical cryomicroscopy, and UV-VIS spectroscopy. The calorimetric studies show the vitrification and crystallization of concentrated solutions in veins. The optical cryomicroscopy shows the morphological changes of the frozen samples. The freezing-induced acidity changes of buffered solutions were examined by UV-VIS absorption spectroscopy using sulfonephthalein dyes as acid-base indicators. The thesis also proposes solutions to mitigate the freezing-induced acidity change of buffer solutions by (1) choosing a certain concentration of buffers, (2) mixing two buffers showing opposite freezing-induced acidity change, and (3) adding appropriate concentrations of sugars. The outcomes of this thesis may offer novel options for improving the techniques adopted in freezing and lyophilization.

Keywords

freezing, freezing-induced acidity change, sulfonephthalein indicators, buffers, sugars, acidity

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 5. 1. 2024

Thesis defence

• Date of defence: 23. 1. 2024
• Supervisor: doc. Mgr. Dominik Heger, Ph.D.
• Reader: RNDr. Dana Nachtigallová, Ph.D., Dr. Evgenyi Shalaev

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Chemistry / Physical Chemistry