Reakce včelího imunitního systému na patogenní stimul

Bc. Markéta KRHUTOVÁ

Diplomová práce

Response of the bee immune system to a pathogenic stimulus

Anotace:

Imunitu hmyzu tvoří vrozený imunitní systém, který se skládá z fyzikálních bariér, buněčné imunity a imunity humorální. Buněčná imunita je zprostředkována buňkami cirkulujícími v hemolymfě, hemocyty, se schopností fagocytózy, nodulace či enkapsulace. Humorální imunita spočívá v produkci rozmanitých antimikrobiálních peptidů, ke které dochází díky signálním drahám, které jsou spuštěny po rozpoznání patogenních struktur příslušnými receptory. Do této úrovně imunity řadíme také fenoloxidasovou kaskádu včetně jejího klíčového enzymu, fenoloxidasy. Po ověření specifity protilátek metodou Western blot byla optimalizována metoda ELISA a s využitím této metody bylo stanoveno relativní zastoupení tří antimikrobiálních peptidů. Apidaecin byl kvantifikován s využitím vysokoúčinné kapalinové chromatografie na reverzní fázi spojené s hmotností spektrometrií, při které byla použita ionizace elektrosprejem a analýza kvadrupólem s analyzátorem doby letu (UHPLC-ESI-Q-TOF). Byla také optimalizována metoda spektrofotometrického měření aktivity enzymu fenoloxidasy. Veškeré parametry imunitního systému byly stanovovány ve vzorcích včelí hemolymfy tří experimentálních skupin, kontroly, dále včel, které byly krmeny směsí inaktivovaných bakterií a včel krmených lipopolysacharidem (LPS). Byla ověřena specifičnost protilátek proti defensinu a abaecinu s následnou imunochemickou detekcí defensinu-1, abaecinu a hymenoptaecinu ve vzorcích. Byla prokázána indukce produkce defensinu-1 LPS a stejně tak rozdílnost v aktivaci imunitního systému včel při imunizaci krmením či injekcí. Koncentrace apidaecinu nevykazovala mezi experimentálními skupinami statisticky významné rozdíly. Byla optimalizována metoda stanovení enzymu fenoloxidasy. Měřením byla prokázána možnost měřit enzymovou aktivitu i ze zamražených vzorků.

Abstract:

Insect immunity consists of the innate immune system, which is composed of physical barriers, cellular immunity and humoral immunity. Cellular immunity is mediated by cells circulating in the haemolymph, haemocytes, with the ability to phagocytose, nodulate or encapsulate. Humoral immunity consists of the production of diverse antimicrobial peptides, which occurs through signaling pathways that are triggered upon recognition of pathogenic structures by corresponding receptors. This level of immunity also includes the phenoloxidase cascade with its key enzyme, phenoloxidase. After verifying the specificity of the antibodies by Western blotting, the ELISA method was optimized and the relative abundance of the three antimicrobial peptides was determined using this method. Apidaecin was quantified using reversed-phase high-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry using electrospray ionization and quadrupole analysis with a time-of-flight analyzer (UHPLC-ESI-Q-TOF). A method for spectrophotometric measurement of phenoloxidase enzyme activity was also optimized. All parameters of the immune system were determined in the hemolymph samples from bees of the three experimental groups, controls, bees fed a mixture of inactivated bacteria and bees fed lipopolysaccharide (LPS). The specificity of antibodies against defensin and abaecin was verified, followed by immunochemical detection of defensin-1, abaecin and hymenoptaecin in the samples. Induction of defensin-1 production by LPS was demonstrated, as well as differences in the activation of the immune system of bees when immunized by feeding or injection. The concentration of apidaecin did not show statistically significant differences between the experimental groups. The method for the determination of the enzyme phenoloxidase was optimized. Measurements demonstrated the possibility to measure the enzyme activity also from frozen samples.

Klíčová slova

Včela medonosná, antimikrobiální peptidy, humorální imunita, apidaecin

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 19. 4. 2024

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Mgr. Jiří Danihlík, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie