Vývoj metody pro detekci a kvantifikaci hmyzích hormonů

Bc. Eliška MORAVCOVÁ

Master's thesis

Development of method for detection and quantification of insects hormones

Abstract:

Endokrinní soustava hmyzu se podílí na regulaci biochemických a fyziologických procesů v těle hmyzu. Její hlavní funkcí je sekrece ekdysteroidů, juvenilních hormonů a neuropeptidických hormonů. Juvenilní hormon je seskviterpenoidní látka syntetizovaná v corpora allata. Podílí se na metamorfóze hmyzu, reguluje syntézu vitellogeninu a má vliv na dlouhověkost včel, polymorfismus a tvorbu kast ve včelstvu. Diplomová práce je věnována optimalizaci metody vysokoúčinné kapalinové chromatografie ve spojení s ionizací elektrosprejem a analyzátorem doby letu (UHPLC - ESI-QTOF) pro detekci a kvantifikaci juvenilního hormonu III. Pro chromatografickou separaci byla zvolena Arion C8 HPLC kolona (150 × 2,1 mm) s mobilní fází tvořenou A: voda + 10mol.l-1 mravenčan amonný + 0,1% kyselina mravenčí; B: 90% acetonitril + 0,1% kyselina mravenčí. Eluce probíhala gradientově s průtokem 400 ul/min. Jako vhodné rozpouštědlo pro JH III byl zvolen 90% acetonitril. Pro kvantifikaci JH III byl zvolen jako vnitřní standard methopren. Byla změřena MS spektra pro methopren, přičemž nejvyšší intenzitu měl pík pro fragment methoprenu o m/z 279,23. Dalším dostupným interním standardem pro kvantifikaci JH III byl deuteriem značený JH-D3, pro který byly taktéž změřeny MS spektra. JH-D3 se v průběhu ionizace rozpadal na neznačený fragment o m/z 235,17, což odpovídá i fragmentu neznačeného JH III, tudíž JH-D3 nemohl být využit jako interní standard. Proto byl pro následnou kvantifikaci zvolen methopren jako interní standard. Juvenilní hormon III byl izolován z včelí hemolymfy směsí extrakčních činidel isooktan-methanol. Pro extrakci byly použity LB silylované mikrozkumavky a vialky. Výtěžnost pro plochy píku IS a JH III po extrakci byla v průměru 55 ? 7,5 % pro IS a 87 ? 4,5 % pro JH III. JH III byl kvantifikován z hemolymfy pomocí externě sestrojené kalibrační řady a metodou standardního přídavku. Průměrná hodnota JH III ve včelí hemolymfě byla byla 230,5 ? 30,5 pg.ul-1. V praktické části se podařilo optimalizovat a částečně validovat metodu UHPLC - ESI-QTOF pro detekci a kvantifikaci juvenilního hormonu III z hemolymfy Apis mellifera. Metodu je třeba dále validovat a verifikovat, aby mohla posloužit pro další studium JH III u A. mellifera.

Abstract:

Abstract The insect endocrine system is involved in the regulation of biochemical and physiological processes in the insect body. Its main function is the secretion of ecdysteroids, juvenile hormones and neuropeptide hormones. Juvenile hormone is a sesquiterpenoid substance synthesized in the corpora allata. It is involved in insect metamorphosis, regulates vitellogenin synthesis, and influences honeybee longevity, polymorphism, and caste formation in the colony. This thesis is devoted to the optimization of a high-performance liquid chromatography method coupled with electrospray ionization and time-of-flight analyzator (UHPLC-ESI-QTOF) for the detection and quantification of juvenile hormone III. For chromatographic separation was chosen Arion C8 HPLC column (150 × 2,1 mm) with a mobile phase consisting of A: water + 10 umol.l-1 ammonium formate + 0.1% formic acid; B: 90% acetonitrile + 0.1% formic acid. The elution was carried out in a gradient manner with a flow rate of 400 ml/min. 90% acetonitrile was chosen as a suitable solvent for JH III. Methoprene was chosen as an internal standard for the quantification of JH III. MS spectra for methoprene were measured, with the highest intensity peak for the methoprene fragment m/z 279.23. Another available internal standard for JH III quantification was deuterium-labeled JH-D3, for which MS spectra were also measured. During ionization JH-D3 fragmented to an unlabeled fragment m/z 235,17, which also corresponds to the fragment of unlabeled JHII, thus JH-D3 could not be used as an internal standard. Therefore, methoprene was chosen as the internal standard for quantification. Juvenile hormone III was extracted from honeybee hemolymph with a mixture of isooctane-methanol extraction reagents. LB silylated microtubes and vials were used for extraction. The recoveries for the peak areas of IS and JH III after extraction averaged 55 ?7,5% and 87 ? 4.5% for IS and JH III. JH III was quantified from haemolymph using an externally constructed calibration curve and the standard addition method. The mean value of JH III in bee haemolymph was 230.5? 30.5 pg.ul-1. In the practical part, UHPLC-ESI-QTOF method for the detection and quantification of juvenile hormone III from Apis mellifera hemolymph was optimized and partially validated. The method needs to be further validated and verified to serve for further studies of JH III in A. mellifera.

Keywords

Juvenilní hormon III, ekdysteroidy, LCMS, hormony

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 21. 4. 2024

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Jiří Danihlík, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry