Detekce druhového zastoupení masa v krmivech pro psy a kočky pomocí metody PCR

Andrea Salavcová

Diplomová práce

Detection of meat species in cannine and feline feed by PCR assay

Anotace:

Hlavním zdrojem bílkovin v krmivech pro psy a kočky by měly být suroviny živočišného původu, zejména svalovina hospodářských zvířat. Výrobce často v konečném produktu deklaruje určitý druh masa, jehož identifikace na úrovni proteinů (ELISA) však s ohledem na tepelné zpracování produktu přináší celou řadu komplikací. Druhové zastoupení masa v průmyslově vyráběných krmivech pro psy a kočky lze stanovit na základě použití molekulárně biologických metod, konkrétně pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). Jejíž vlastnosti nám, s využitím sady druhově specifických primerů (tzn. multiplex PCR), umožní v jednom vzorku identifikovat více živočišných druhů. Náplní této diplomové práce bylo ověřit použitelnost metody multiplex PCR pro identifikaci původu živočišné bílkoviny ve vzorcích komerčně vyráběných krmiv pro psy. Dále na základě výsledků diskutovat vhodnost použité metody k výše zmíněné analýze a pravdivost výrobci deklarovaného složení granulovaných krmiv pro psy a kočky. V souboru 54 vzorků komerčně dostupných krmiv pro psy a kočky bylo stanoveno druhové zastoupení masa (hovězí, vepřové, skopové, kuřecí, koňské a kozí). Jak již bylo zmíněno, k detekci byla využita multiplexní PCR s druhově specifickými primery pro jednotlivé druhy detekovaného masa. Získané PCR produkty se vizualizovaly pomocí nativní gelové elektroforézy. Následně byly výsledky porovnány se složeními uvedenými na obalech výrobků. Z celkového počtu 54 analyzovaných vzorků krmiv pro psy a kočky vyhovovalo deklarovanému složení 32 vzorků. Jeden vzorek byl pro neúspěšnou izolaci DNA z analýzy vyřazen a u jednoho vzorku krmiva nebyl detekován žádný druh živočišné bílkoviny. U 21 vzorků byly zjištěny odchylky od údajů uvedených na obalu krmiva. V nevyhovujících vzorcích buď chyběl druh masa uvedený ve složení, nebo byl kromě udaných druhů přítomen i jiný druh masa. Výsledky byly porovnány se standardy, tj. s DNA původem z čisté kosterní svaloviny jednotlivých živočišných druhů zahrnutých do analýzy. Do experimentu byla rovněž zařazena negativní kontrola. Analýza DNA pomocí multiplexní PCR představuje vhodnou metodu testování bílkovinného složení granulovaných krmiv pro psy a kočky. S ohledem na získané výsledky lze doporučit zejména krmiva a speciální diety renomovaných a důvěryhodných výrobců, kteří výzkumu v oblasti výživy věnují nemalou pozornost, dodržují přísné technologické a hygienické postupy a plní deklarované receptury, čímž zaručují krmiva vysoké kvality. Použitá metoda má jistá omezení zejména v úvodu analýzy, tj. během izolace DNA. Použitý izolační kit v několika případech nezajistil zcela čistý produkt, což zapříčinilo kontaminaci nukleových kyselin. Rovněž rozlišení PCR produktů elektroforeticky není 100% spolehlivé, produkty se od sebe délkou liší pouze v rozmezí 41-282 bp, což analýzu může komplikovat.

Abstract:

The main source of proteins in canine and feline feed should be ingredients of animal origin, especially from muscles of agricultural animals. A producer often declares that there is a certain type of meat in the product, but its identification on protein level (by ELISA) is very complicated because of thermal processing of the product. Representation of types of meat in industrially produced dog and cat feed can be determined using molecular biological methods, specifically by the polymerase chain reaction (PCR). The characteristics of this method help to identify various animal species in one sample with the use of the set of species-specific primers (multiplex PCR). The intention of this thesis was the verification of the use of multiplex PCR for identification of origin of animal proteins in samples of commercially produced dog feed and, on the basis of the results, the discussion about the suitability of the used method for above mentioned analysis and the verity of composition of granular dog and cat feed declared by the producers. Representation of meat types (bovine, pork, mutton, chicken, horse and goat's) was determined in a set of 54 samples of commercially available dogs and cats' feeds. As already mentioned, the method used was multiplex PCR with species-specific primers for individual types of detected meat. The acquired PCR products were visualised using native gel electrophoresis. Afterwards the results were compared with the composition of the product mentioned on the products' packages. From the total amount of 54 analysed samples of dog and cat feed 32 samples agreed with the declared composition. One sample was eliminated from the analysis because of unsuccessful isolation of DNA and in one sample there was not detected any type of animal proteins. In 21 samples there were identified deviations from the composition declared on the package. In unsuitable samples there was missing either a type of meat declared in the composition, or they contained another type of meat that was not declared in the composition. The results were compared with the standards, i.e. with the DNA originating from pure skeletal muscles of individual animal species included in the analysis. Negative control was also included in the experiment. The analysis of DNA using multiplex PCR represents a suitable method of testing of protein composition of granulated dog and cat feed. In view of the received results it is possible to especially recommend feed and special diets from respected and trustworthy producers, who are devoting considerable attention into the research of nutrition, follow strict technological and hygienic procedures and fill declared formulas, thereby guaranteeing high quality of the feed. The used method has certain limits, especially at the beginning of the analysis, i.e. during the isolation of DNA. The used isolation kit did not guarantee a completely clear product in several cases, which caused contamination of the nucleic acids. Also differentiation of PCR products by electrophoresis is not 100 % reliable, products differ in length ranging between 41 and 282 bp, which can complicate the analysis.

Klíčová slova

maso, PCR, bílkoviny, výživa psa a kočky, detekce

Keywords

PCR, proteins, dog and cat nutrition, detection, meat

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 30. 4. 2015

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: doc. MVDr. Eva Skřivanová, Ph.D.
• Oponent: Michaela Englmaierová, externi

Česká zemědělská univerzita v Praze

Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů

Magisterský studijní program / obor:
Zootechnika / Výživa zvířat a dietetika