Molecular mechanisms of neural stem cells generation and regulation - in vitro studies

Mgr. Hana Kotasová, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Nervové kmenové buňky jsou nediferencované buňky schopné sebeobnovy a diferenciace v neurony, astrocyty a oligodendrocyty. Během embryonálního vývoje jsou za první nervové kmenové buňky považovány neuroepitelové buňky nervové trubice. Při dalším vývoji neuroepitelové buňky mění svou expresi a diferencují v radiální glie. Neuroepitelové buňky a později i radiální glie dávají vznik transientně se dělícím progenitorům, které diferencují do všech typů nervových buněk centrálního nervového systému. Nervový vývoj je regulován mnoha signálními dráhami a transkripčními faktory, které působí, jak napříč celou nervovou trubicí, tak v místním mikroprostředí. Tato dizertační práce je zaměřena na regulaci diferenciace embryonálních kmenových buněk do buněk nervových. K indukci nervové diferenciace jsme použili kyselinu retinovou. Tato indukce se rutinně používá během nervové diferenciace pomocí tvorby embryoidních tělísek. Zjistili jsme, že neurogeneze indukovaná kyselinou retinovou je podporována předchozí aplikací inhibitoru kinázi PI3K. Je zajímavé, že nervová diferenciace embryonálních kmenových buněk je díky tomuto předpůsobení pozorována také při kultivaci v adherované vrstvě. Nepotvrdili jsme však, že mechanismem tohoto účinku je snížení exprese transkripčního faktoru Nanog. Dále jsme se zaměřili na regulaci vlastností nervových kmenových buněk aktivací signálních drah Notch a gp130. Tyto dráhy mají podobný účinek na proliferaci a diferenciaci nervových kmenových buněk. Zavedli jsme metodu tvorby neurosfér a analyzovali jsme účinek aplikace inhibitorů signalizace Notch a gp130 na tvorbu primárních a sekundárních neurosfér. Zjistili jsme, že po inhibici Notch a STAT3 došlo ke zvýšení exprese markerů nervových progenitorů v sekundárních neurosférách, ale v primárních neurosférách jsme podobný účinek nepozorovali. Také jsme zjistili, že aktivace signalizace gp130 zřejmě brání diferenciaci primitivních nervových kmenových buněk do definitivních.

Abstract:

Neural stem cells are undifferentiated cell, which are self-renewing and can differentiate into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. During embryonal development first progenitors, which can be considered as neural stem cells, are neuroepithelial cells of neural tube. As development proceeds, neuroepithelial cells change their gene expression pattern and differentiate in radial glial cell. Neuroepithelial cells and later radial glial cells give rice to transit-amplifying progenitors, which differentiate into all types of neural cell of central nervous system. The neural development is regulated by many signaling pathways and transcription factors across the neural tube, but also in local microenvironment. This dissertation thesis is focused on regulation of differentiation of embryonic stem cells into neural cells. We used induction of neural differentiation by retinoic acid. This induction was routinely used during differentiation by aggregating mouse embryonic stem cells into embryoid bodies. We found that retinoic acid-induced neurogenesis is supported via pretreatment with PI3K inhibitor. Interestingly, due to this pretreatment, retinoic acid-induced neural differentiation of embryonic stem cells can be obtained also in monolayer culture. We did not confirm the hypothesis that the mechanism of this effect is trough decreasing of Nanog expression. Further we focused on regulation of neural stem cells properties by activation of Notch and gp130 signaling pathways. Notch and gp130 signaling pathways have simillar effect on the proliferation and differentiation of neural stem cells. We established the neurosphere assay and analysed effect of treatment with Notch and gp130 inhibitors on generation of primary and secondary neurospheres. We observed the increasing of neural progenitor markers expression after Notch and STAT3 inhibition in secondary neurospheres, but no simillar efect in primary neurospheres. We also found that the activation of gp130 signaling apparently prevents the differentiation of primitive neural stem cells into definitive neural stem cells.

Keywords

nervové kmenové buňky, embryonální kmenové buňky, diferenciace, vývoj nervové trubice neural stem cells, embryonic stem cells, differentiation, development of neural tube

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 11. 2012

Thesis defence

• Date of defence: 13. 12. 2012
• Supervisor: Mgr. Jiří Pacherník, Ph.D.
• Reader: doc. RNDr. Marcela Buchtová, Ph.D., MUDr. Jan Cendelín, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology