Regulace diferenciace lidských pluripotentních kmenových buněk manipulací signálování FGF2

Mgr. Tereza Váňová, Ph.D.

Doctoral thesis

Regulation of cell fate decisions in human pluripotent stem cells by manipulation with FGF2 signaling

Abstract:

Lidské pluripotentní kmenové buňky (PSCs) jsou in vitro udržovány v nediferencovaném stavu exogenně přidávaným fibroblastovým růstovým faktorem (FGF2). Lidské PSCs samy produkují FGF2, který je sekretován do extracelulárního prostoru, kde spouští autokrinní/parakrinní signalizaci. V první části své disertační práce jsem analyzovala, zda je sekrece FGF2 z lidských PSCs spojena s aktivitou tyrosin kinázy exprimované v hepatocelulárním karcinomu (TEC) a jak se autokrinní/parakrinní signalizace zprostředkovaná TEC kinázou podílí na diferenciaci lidských PSCs. Významné narušení sekrece FGF2 snížením exprese TEC kinázy pomocí krátké vlásenkové (sh) RNA potvrdilo úlohu TEC kinázy v FGF2 sekreci u lidských PSCs. Cílená diferenciace lidských PSCs se sníženou expresí TEC odhalila nezbytnost TEC kinázy a funkčního sekrečního mechanismu FGF2 v mesodermální diferenciaci a zároveň nutnost jejich potlačení při vzniku neuroektodermu. Ve druhé části své práce jsem využila vysoce definované buněčné populace získané hepatickou diferenciací lidských PSCs ke sledování toxických účinků v přírodě značně rozšířeného sinicového toxinu cylindrospermopsinu (CYN). Řízená diferenciace lidských PSCs rekapituluje embryonální vývoj a umožňuje nejen analýzu zralých hepatocytů, ale i studium buněk s podobnými vlastnostmi jaké mají nezralé jaterní buňky během embryonálního vývoje, a hepatoblasty účastnící se sebeobnovy a regenerace jater. Působením CYN na jednotlivá diferenciační stádia byly zjištěny rozdílné účinky v závislosti na zralosti jaterních buněk. CYN selektivně odstranil z buněčné populace nezralé buňky charakteristické expresí HNF4α, zbylé nezralé hepatocyty vykazovaly sníženou životaschopnost a schopnost maturace. Současně byly detekovány rozdílné mechanismy buněčné smrti vyvolané u zralých a nezralých jaterních buněk po působení CYN: u progenitorových buněk převládala apoptóza zatímco u maturovaných buněk nekróza. Účinek CYN na zralé hepatocyty i buňky podobné hepatoblastům odvozené z lidských PSCs kromě hepatotoxicity ukazuje i na možné negativní ovlivnění embryonálního vývoje a schopnosti regenerace jaterní tkáně při expozici tomuto toxinu.

Abstract:

Human pluripotent stem cells (PSCs) are in vitro maintained in undifferentiated state by exogenously administered fibroblast growth factor 2 (FGF2). Human PSCs also produce FGF2, which is secreted into extracellular space to trigger autocrine/paracrine signaling. In the first part of my thesis I analyzed possible connection between FGF2 secretion from human PSCs and activity of tyrosine kinase expressed in hepatocellular carcinoma (TEC) and involvement of TEC-mediated autocrine/paracrine FGF2 signaling in human PSCs differentiation. Downregulation of the TEC kinase by short hairpin (sh) RNA significantly impaired FGF2 secretion implicating TEC function in FGF2 secretory mechanism of human PSCs. Directed differentiation of human PSCs with downregulated TEC revealed important role of TEC kinase and functional FGF2 secretion in mesodermal differentiation as well as the necessity of their downregulation during neuroectoderm formation. In the second part of the thesis I utilized well defined populations of human PSCs-derived hepatic cells to uncover biological effects of widely spread cyanotoxin cylindrospermopsin (CYN) on hepatic differentiation and/or regeneration. Directed differentiation of human PSCs recapitulates embryonic development and enables to analyze mature hepatocytes as well as to study cells similar to developing immature hepatocytes and hepatoblasts participating in liver self-renewal and regeneration. Distinct CYN effects were observed depending on the developmental stage of hepatic cells. Immature HNF4α-positive cells were selectively eliminated from hepatic population after CYN exposure and surviving cells presented decreased viability and impaired ability to further differentiate. Different cell death mechanisms induced by CYN treatment were detected in mature and immature hepatic cells: apoptosis was predominantly activated in progenitors and immature cells while necrosis prevailed in mature hepatic cell. Observed CYN actions on human PSCs-derived hepatoblast-like and hepatocyte-like cells suggest beside induction of hepatotoxic effects also possible negative impact of CYN exposure on embryonic development and regeneration of liver tissue.

Keywords

Human pluripotent stem cells, FGF2, TEC kinase, differentiation, hepatotoxicology, cylindrospermopsin, lidské pluripotentní kmenové buňky, TEC kináza, diferenciace, hepatotoxikologie

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 21. 2. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 29. 3. 2018
• Supervisor: prof. Ing. Petr Dvořák, CSc.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Medical Biology (4-years) / Medical Biology