Příprava a funkční charakterizace rekombinantního lektinu RS20L

Bc. Lucie Olšová

Master's thesis

Preparation and functional characterisation of the recombinant RS20L lectin

Abstract:

V centru pozornosti této diplomové práce se nachází protein RS20L produkovaný gramnegativní rostlinnou bakterií Ralstonia solanacearum. Přes veškeré snahy o funkční charakterizaci lektinu RS20L nebyly zatím tyto studie dokončeny. Ukázalo se, že po purifikaci protein ztratil své vazebné schopnosti. Za jednu z množných příčin lze považovat silnou vazbu mannosy, která obsadila vazebné místo lektinu při purifikaci na mannan-agarosové koloně a následné eluci mannosou. Poté ji nebylo možné odstranit ani dialýzou. Možným řešením se jevilo připojení oligohistidinové kotvy a následná purifikace za pomoci metalochelatační chromatografie, čímž by se zamezilo navázání sacharidu do vazebného místa během purifikace. Praktické řešení tohoto problému in vitro bylo započato úspěšným vložením syntetického genu rs20l do vektoru pET-32c, který obsahoval sekvenci kódující His-tag na N-terminálním konci. Tím byl vyřešen problém s připojením oligohistidinové kotvy a byla umožněna purifikace lektinu RS20L jiným způsobem než využitím jeho schopnosti vázat mannosu. Purifikace lektinu RS20L proběhla na Ni-NTA koloně za využití interakce histidinů s iontem kovu navázaným na sorbentu imobilizovaném na agarosovém nosiči. Získaný lektin RS20L nebyl čistý, neboť došlo k současné eluci i dalších proteinů. Jako druhá možnost byla testována exprese proteinu s oligohistidinovou kotvou na C-konci. Na základě úspěšného připojení His-tagu k C-terminálnímu konci RS20L mohla být provedena optimalizace exprese v různých expresních kmenech E. coli a následná purifikace RS20L. Jejím výsledkem byla bohužel směs různých proteinů – nepodařilo se tedy ani tentokrát získat protein RS20L v čisté podobě. Dalším způsobem přípravy rekombinantního proteinu, avšak bez připojení oligohistidinové kotvy, bylo překlonování syntetického genu rs20l z buněk TOP10 do expresního vektoru pRSET. Takto úspěšně vytvořený rekombinantní protein by mohl být využit pro následné strukturní studie. V souvislosti s výše uvedenými kroky, při kterých zatím nebylo dosaženo čisté formy proteinu RS20L, byla obrácena pozornost k nalezení vhodných kandidátů pro budoucí funkční studie za účasti později získaného čistého proteinu. Zdrojem případných vhodných kandidátů, kteří byli vyhledáváni in silico za použití dokovacího programu Glide, sloužily databáze sloučenin NCI a katedry farmakognozie DP_M a DP_N.

Abstract:

This diploma thesis is focused on protein RS20L produced by Gram-negative bacteria Ralstonia solanacearum. Function studies of this lectin has not been finished yet, because protein lost its binding abilities after purification on mannan-agarose column. One of the possible reasons could be very strong binding of mannose to the binding site of lectin during purification where mannose was used for protein elution. It couldn´t be removed even by dialysis. The attachment of His-tag to the protein followed by purification on Ni-NTA column without using mannose could be solution to this problem. Practical solution to this problem was started by successful insertion of the rs20l gene into the vector pET-32c, which resulted in a protein containing a sequence encoding His-tag on N-terminal end. This allowed for purification of RS20L using immobilised metal-ion affinity chromatography on Ni-NTA agarose without presence of mannose during purification. However, the obtained protein was not pure enough. Due to a subsequent successful attachment of His-tag to C-terminal end of RS20L optimization of expression conditions in various E. coli strains and purification could be done. Though, obtained protein RS20L wasn´t pure again. The third recombinant protein, which was prepared, was constructed by insertion of a synthetic gene rs20l to the pRSET expression vector. This recombinant protein could be used for structural studies in future. Being unable to obtain pure protein RS20L, we focused our attention to find new suitable candidates for future function studies, where later gained pure protein would be present. These candidates were searched in silico by using docking programme Glide from databases NCI and from the department of pharmacognosy DP_M and DP_N.

Keywords

Lektin, RS20L, Ralstonia solanacearum

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 12. 5. 2011

Thesis defence

• Date of defence: 7. 6. 2011
• Supervisor: prof. RNDr. Michaela Wimmerová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Analytical Biochemistry