Extracellular vesicles as mediators of intercellular communication in the gastrointestinal tract

Mgr. Miriam Dutková, Ph.D.

Disertační práce

Anotace:

Gastrointestinální trakt (GIT) představuje vysoce interaktivní prostředí, v němž epiteliální a imunitní buňky neustále reagují na signály od střevní mikrobioty. Extracelulární vezikuly (EV) jsou dnes považovány za důležité mediátory mezibuněčné komunikace. Úloha membránových vezikul (MV) grampozitivních bakterií a extracelulárních vezikul uvolňovaných makrofágy (MfEV) v regulaci vrozené imunity však dosud nebyla dostatečně objasněna. Tato disertační práce se zaměřuje na mechanismy, jimiž bakteriální MV iniciují imunitní odpověď hostitele, a na následný přenos těchto signálů prostřednictvím EV produkovaných makrofágy. Tímto způsobem vzniká vezikulami zprostředkovaná komunikační dráha, která hraje významnou roli v udržování střevní homeostázy i v rozvoji zánětlivých procesů. MV z kmenů Lacticaseibacillus rhamnosus CCM7091 (Lr) a Enterococcus faecium CCM7167ᵀ (Ef) byly izolovány pomocí optimalizovaného postupu se sacharózovým polštářem. Jejich charakterizace byla provedena kryogenní elektronovou mikroskopií, metodou MADLS (Multi-Angle Dynamic Light Scattering), SDS–PAGE a Western blottingem v souladu s doporučeními Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2023 (MISEV2023). Analýzy potvrdily pouze minimální přítomnost částic pocházejících z kultivačního média. Integrita vezikul a jejich odlišení od agregátů barviv byly ověřeny pomocí dvojitého značení Octadecyl Rhodamine B Chloride (R18) a karboxyfluorescein diacetát sukcinimidyl esteru (CFSE). V MV odvozených z obou bakteriálních kmenů byla detekována lipoteichoová kyselina (LTA), klíčový ligand Toll-like receptoru 2 (TLR2); její struktura byla následně potvrzena analýzou purifikovaných LTA z mateřských buněk Lr a Ef pomocí nukleární magnetické rezonance (NMR). Analýza vlivu růstové fáze ukázala výrazné změny ve složení MV produkovaných kmenem Lr. MV izolované z pozdní stacionární fáze byly obohaceny o imunoaktivní proteiny a vykazovaly vyšší obsah LTA, což se projevilo zesílenou aktivací makrofágů RAW264.7 prostřednictvím TLR2. V primárních makrofázích odvozených z kostní dřeně (BMDM) poskytovaly MV signál pro priming inflammasomu; nejvýraznější a nejkonzistentnější indukce markerů primingu byla pozorována u vzorku MV6, zatímco k plné aktivaci inflammasomu byl nezbytný další, sekundární podnět. Analýzy závislé na růstové fázi odhalily výraznou remodelaci složení MV z Lr. MV z pozdní stacionární fáze byly obohaceny o imunoaktivní proteiny a obsahovaly vyšší množství LTA, což vedlo k zesílené TLR2-závislé aktivaci makrofágů RAW264.7. MV v primárních makrofázích odvozených z kostní dřeně BMDM indukovaly priming inflammasomu, nejvýrazněji u vzorku MV6, zatímco k jeho plné aktivaci byl zapotřebí další signál. V další části práce byly důsledky bakteriální stimulace hodnoceny se zaměřením na EV uvolňované makrofágy po expozici lipopolysacharidu (LPS) nebo bakteriálnímu lyzátu kmene Lr (BL). Ačkoli celkový výtěžek a morfologie EV zůstaly nezměněny, proteinové analýzy prokázaly selektivní obohacení flotilinu-2 a indukovatelné syntázy oxidu dusnatého (iNOS) v reakci na bakteriální stimulaci. LTA byla detekována výhradně v MfEV pocházejících z makrofágů stimulovaných BL. Komplexní lipidomická analýza odhalila rozsáhlou remodelaci membrán makrofágů i jejich EV, včetně zvýšení obsahu ceramidů, sfingolipidů a nasycených mastných kyselin. MfEV uvolněné po bakteriální stimulaci byly efektivněji internalizovány a v naivních makrofázích indukovaly vyšší produkci TNFα, oxidu dusnatého (NO) a iNOS, zatímco endoteliální buňky reagovaly rozdílnou expresí cytokinů a adhezních molekul v závislosti na typu stimulu. In vivo byly iNOS-pozitivní EV detekovány v modele

Anotace:

ch akutního peritoneálního zánětu a peritoneální fibrózy, což potvrzuje jejich fyziologickou relevanci. Tyto výsledky ukazují, že membránové vezikuly grampozitivních bakterií spouštějí vrozenou imunitní odpověď makrofágů a že aktivované makrofágy tyto mikrobiální podněty dále šíří prostřednictvím uvolňování molekulárně pozměněných EV. Tato práce popisuje obousměrnou, vezikulami zprostředkovanou komunikační dráhu propojující bakterie, makrofágy a další buňky hostitele a přispívá tak k hlubšímu porozumění tomu, jak extracelulární vezikuly formují imunologické interakce v prostředí GIT.

Abstract:

The gastrointestinal tract (GIT) represents a highly interactive environment in which epithelial and immune cells continuously respond to signals derived from the resident microbiota. Extracellular vesicles (EVs) have emerged as important mediators of this intercellular communication, yet the contribution of Gram-positive bacterial membrane vesicles (MVs) and macrophage-derived EVs (MfEVs) to innate immune regulation remains poorly defined. This thesis investigates how MVs initiate host responses and how macrophages (Mfs) transmit these signals further via their own EVs, thereby forming a vesicle-mediated communication axis relevant to intestinal homeostasis and inflammation. MVs from Lacticaseibacillus rhamnosus CCM7091(Lr) and Enterococcus faecium CCM7167T (Ef) were isolated using an optimized sucrose-cushion workflow and characterized by cryogenic electron microscopy, Multi-Angle Dynamic Light Scattering (MADLS), SDS–PAGE and Western blotting in accordance with Minimal information for studies of EVs 2023 (MISEV2023) guidelines. Minimal levels of medium-derived particles were confirmed. A dual-labeling Octadecyl Rhodamine B Chloride (R18)/carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) approach validated vesicle integrity and ensured reliable discrimination from dye aggregates. Lipoteichoic acid (LTA), a key Toll-like-receptor 2 (TLR2) ligand, was detected in both Lr- and Ef-derived MVs and structurally verified using strain-matched purified standards analyzed by nuclear magnetic resonance (NMR). Growth-phase–dependent analyses revealed that Lr MVs undergo substantial compositional remodeling. Late-stationary MVs were enriched in immunoactive proteins and contained more LTA, resulting in enhanced TLR2-dependent activation of RAW264.7 Mfs. In primary bone marrow-derived Mfs (BMDMs), MVs provided a clear inflammasome-priming signal, with MV6 showing the most consistent induction of priming markers, although full inflammasome activation required an additional secondary signal. Downstream consequences of bacterial stimulation were examined by profiling MfEVs released after Mf exposure to lipopolysaccharide (LPS) or Lr bacterial lysate (BL). While overall EV yield and morphology were unchanged, protein analyses showed selective enrichment of flotillin-2 and inducible nitric oxide synthase (iNOS), and LTA was detected exclusively in MfEVs from BL–stimulated Mfs. Comprehensive lipidomics revealed extensive remodeling of both Mf membranes and EVs, including increases in ceramides, sphingolipids, and saturated fatty acids. Functionally, bacteria-stimulated MfEVs displayed enhanced uptake and triggered elevated TNFα, nitric oxide (NO), and iNOS in naïve Mfs, whereas endothelial cells responded with differential cytokine and adhesion-molecule expression depending on the upstream stimulus. In vivo, iNOS-positive EVs were detected in models of acute peritoneal inflammation and peritoneal fibrosis, confirming their physiological relevance. Together, these findings demonstrate that Gram-positive MVs initiate innate immune signaling in Mfs and that stimulated Mfs propagate these microbial cues through the release of molecularly remodeled EVs. This work reveals a bidirectional vesicle-mediated communication pathway linking bacteria, Mfs, and other host cells, thereby advancing our understanding of how EVs shape immunological interactions within the GIT.

Keywords

bacterial extracellular vesicles, macrophage-derived EVs, lipoteichoic acid, innate immune signaling, lipid remodeling, microbiota–host communication

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 9. 1. 2026

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 27. 2. 2026
• Vedoucí: Mgr. Kristýna Turková, Ph.D.
• Oponent: doc. Sabina Górska, Ph.D., doc. PharmDr. Ivona Pávková, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Fyziologie, imunologie a vývojová biologie živočichů / Fyziologie, imunologie a vývojová biologie živočichů