Studium DNA a magnetických nosičů metodou mikroskopie atomárních sil

Mgr. Hana ZAPLETALOVÁ

Disertační práce

Anotace:

Mikroskopie atomárních sil je relativně novou, minimálně invazivní zobrazovací a analytickou metodou, která je používána v širokém spektru analyzovaných vzorků a aplikací. Mikroskopie atomárních sil je založena na kombinaci rastrového skenování v rovině XY vzorku a citlivého nano posunu v ose Z zprostředkovaného piezo systémem, monitorovaným nejčastěji optickou cestou. Vedle zobrazovací funkce v 2D a 3D rekonstrukci obrazu je mikroskopie rozšířena o analýzu povrchových vlastností vzorku, jako je analýza lokální tuhosti (elasticity), hrubosti povrchu či v případě speciálních nosníku o magnetické vlastnosti studovaných vzorků. V předložené dizertační práci jsem se zabývala třemi různými oblastmi, jejichž spojovacím prvkem byla moderní mikroskopie atomárních sil zaměřená na studium nukleových kyselin. V prvním projektu jsem se zabývala možnostmi uchycení a následného zobrazování nukleových kyselin na slídovém substrátu. Na pracovišti lékařské biofyziky jsem zavedla metodu uchycení molekul nukleových kyselin prostřednictvím bivalentních kationtů a prostřednictvím triethoxysilanů - plynnou a kapalnou formou. Vzhledem k tomu, že uchycení nukleových kyselin těmito metodami nebylo dostatečně stabilní pro opakované zobrazování v kapalině, byla dále zavedena a optimalizována syntéza triethoxysilatranu, méně citlivého cross-linkeru, používaného standardně k uchycení nukleových kyselin na slídovém povrchu ve světových laboratořích (Zapletalová H. et al., 2016a). V druhé části předložené práce jsem se věnovala aplikaci mikroskopie atomárních sil při studiu poškození DNA vyvolaného fotodynamickým působením. Studované linie MCF-7 byly vystaveny působení dvou fotosenzitizérů: TMPyP a ClAlPcS2. Vlastní poškození DNA jsem sledovala metodou kometové analýzy, AFM analýzy jednotlivých molekul a elektroforézou. Výsledky prokázaly vysokou účinnost obou senzitizérů na vybrané buněčné linii a to již při malých koncentracích a hustotách energie. Apoptotický způsob smrti byl však oproti původnímu předpokladu minimálně zastoupen. Tento jev potvrdila jak gelová elektroforéza, tak AFM analýza (Zapletalová H. et al., 2016b). Třetí oblastí aplikace mikroskopie atomárních sil bylo studium magnetických nosičů, používaných k rutinní izolaci DNA z hrubých vzorků. Povrch magnetických nosičů, komerčních a syntetizovaných, byl analyzován metodou AFM s ohledem na poréznost a drsnost nosičů. Bylo prokázáno, že všechny studované nosiče vykazují nerovný povrch, na němž není možno standardním AFM měřením zobrazit vlákno adsorbované a relaxované DNA tak, aby byla molekula DNA odlišena od pozadí nosiče, tvořeného prostorově strukturovaným povrchem. Nejhladší ze studovaných magnetických nosičů vykazoval Rms (2,1 ? 8,9) nm - pro B 135 ox. Magnetický nosič s největšími výškovými rozdíly na svém povrchu byla částice HPS-B-22-NH2 s Rms (25,5 ? 8,9) nm.

Abstract:

Atomic force microscopy is a relatively new, minimally invasive imaging and analytic method used in a wide range of samples and applications. Atomic force microscopy is based on a combination of raster scan in the XY plane of the sample and the sensitive nano displacement in the Z axis piezo-mediated system. Besides imaging function (2D and 3D image reconstruction) is AFM extended by microscopy analysis of the surface properties of the sample, such as analysis of the local stiffness (elasticity), surface roughness, or in case of special tips on the magnetic properties of the studied samples. This thesis describes the results of three different experiment branches interconnected by DNA as the main experimental object and the technique of atomic force microscopy (AFM). The methodology of immobilization and reproducible imaging was established at Department of Biophysics as described in the first part of made PhD thesis. Three immobilization platforms presented here are based on different immobilization strategies. The first platform exploits imaging of dsDNA attached on mica surfaces via electrostatic interactions through the presence of bivalent cations. The second platform exploits dsDNA attached via alkoxysilanes. The third platform is focused on improvement of APS synthesis and APS-DNA immobilization strategy. AFM topography measurements then monitor the variation of reproducibility, Rms of modified surfaces and height of the undesirable nanostructures at different immobilization strategies. The second part is focused on visualization of DNA changes induced by photodynamic treatment. The changes in DNA length induced by TMPyP and ClAlPcS2 photosensitizers were observed and analysed by AFM, electrophoresis and comet analysis. Direct measurement of the length of DNA strands reveals a shortening of the DNA at very low photosensitiser concentrations and light doses signalling apoptotic process 1M TMPyP and 1J/cm2. Variations in the conformational changes and length that occur in DNA as a result of PDT may have implications for the application. In the third part of PhD thesis the different magnetic micro particles were analysed by AFM. The morphology and surface roughness was analysed. Detail structure analysis and Rms values may have implications for the employment of these particles in the effective and selective reversible DNA attachment in the process of DNA isolation.

Klíčová slova

mikroskopie atomárních sil, DNA, silanizace, APS, poškození DNA, fotodynamická terapie, magnetické nosiče

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 27. 6. 2016

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 29. 8. 2016

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Lékařská fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Lékařská biofyzika / Lékařská biofyzika