Detekce mutací spojovaných se zvýšeným výskytem nádorů prsu a vaječníků pomocí moderních metod molekulární biologie

Kristýna RÁJOVÁ

Bachelor's thesis

Detection of mutations associated with increased incidence of breast and ovarian tumors using modern molecular biology methods

Abstract:

Karcinom prsu a vaječníků je jedno z nejčastějších maligních onemocnění žen v České republice a incidence nových diagnóz má tendence stoupat. Odhaduje se, že v 5 10 % případů těchto nádorů je příčinou patogenní mutace ve vysoce penetrantních tumorsupresorových genech BRCA1 nebo BRCA2. Hlavní funkcí těchto genů jsou opravy zlomů dvouvláknové DNA, kontrola buněčného dělení a spolupodílejí se i na regulaci transkripce a remodelaci chromatinu. Cílem této práce bylo shrnutí současných poznatků na dané téma, genové mutace, funkce genů BRCA1 a BRCA 2 a jejich souvislost s hereditárním karcinomem prsu a vaječníků, přehled možných metod detekce těchto mutací a zvláště také shrnutí českých studií o zabývajících se výskytem mutací BRCA1 a BRCA2 na území České republiky od počátku jejich testování v rámci preventivní i diagnostické péče. To poukázalo na silný efekt zakladatelských mutací. Mezi nejčastěji nalézanými mutacemi v České republice byly mutace c.5266dupC, c.181T>G a c.3700_3704del5 v genu BRCA1 a c.7913_7917del5 a c.8537_8538del2 v genu BRCA2. V experimentální části práce jsem se pokusila optimalizovat metodu PCR ARMS pro detekci bodové mutace c.5266dupC v genu BRCA1. Tato mutace patří mezi nejčastěji se vyskytující mutace nejen v České republice, ale i v Evropě. Cílem bylo optimalizovat metodu PCR ARMS v podmínkách laboratoře GENLABS s.r.o. V rámci optimalizace šlo především o výběr vhodného PCR mixu a úpravu teplotního profilu PCR, při kterém bude kvalita i kvantita výtěžku vizualizovaná pomocí gelové elektroforézy dostatečná pro prokázání přítomnosti či nepřítomnosti mutace u pacienta. V této části práce bylo cílem i praktické zvládnutí izolace DNA z periferní krve a bukálního stěru, příprava a provedení PCR reakce a detekce PCR produktů pomocí gelové elektroforézy. Nakonec se nám podařilo metodu optimalizovat pro dvě různé matrice, pro izolát DNA a periferní krev. Pro bukální stěr se metodu podařilo optimalizovat pouze částečně. Při postupném zvyšování teploty annealingu začínající na teplotě 55 °C, jsme nejlepších výsledků dosáhli při teplotě 65,5 ° za použití kitu gb Basic PCR Master Mix od firmy Generi Biotech. Tato optimalizace může v budoucnu umožnit použití metody pro cílenou detekci mutace c.5266dupC v genu BRCA1 v rámci rutinní praxe v laboratoři.

Abstract:

Breast cancer and ovarian cancer is one of the most common malignancies what women have in the Czech Republic and the incidence of new diagnoses has a tendency to increase. It is estimated that 5-10 per cent of these tumours is cause by pathogenic mutations in highly penetrance tumour suppressor genes BRCA1 or BRCA2. The main function of these genes are repair of double strand DNA breaks and another function is control of cell division and participate on regulation of transcription and chromatin remodeling. The aim of this bachelors thesis is to summarize current knowledge of the "Gene mutations" topic, the function of the genes BRCA1 and BRCA 2 and their link with hereditary breast and ovarian cancer, an overview of possible detection methods and particularly also the summary of the Czech studies of detection mutations in the Czech Republic. It pointed out to the strong effect of the founder mutation. Among the most frequently found mutations are mutations as c.5266dupC, c.181T> G and c.3700_3704del5 in the gene BRCA1 and c.7913_7917del5 and c.8537_8538del2 in the BRCA2 gene. In the experimental part of the work I have tried to optimize ARMS PCR method for point mutation c.5266dupC. This mutation has proved to be one of the most common mutations not only in the Czech Republic but also in Europe. The objective was to optimize the PCR ARMS in the conditions of the GENLABS Ltd. laboratory. The main goal of the optimization was the selection of appropriate PCR mix and optimal temperature of PCR profile at which the quality and quantity of the yield was visualized on gel electrophoresis as specific and highest as it is possible. The aim of this part is also practically to do the DNA isolation from peripheral blood and buccal swab, preparation and execution of the PCR reaction and detection of PCR products by gel electrophoresis. Eventually, we managed to optimize a method for the two different matrices for the DNA isolates, and peripheral blood. Unfortunately the method for the buccal swab was not successful. During gradually temperature increasing, we started the process of annealing at 55°C, the best results were achieved at a temperature of 65.5 ° C using gb Basic PCR Master Mix from the Generi Biotech firm. In the future this optimization might allow the using of method for mutation in the gene BRCA1 c.5266dupC for the routine practise in the laboratory.

Keywords

BRCA1, BRCA2, mutace, PCR ARMS

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 5. 5. 2015

Accessible from:: 5. 5. 2015

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Dagmar Bystřická, Ph.D.

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Health and Social Studies

Bachelor programme / field:
Specialization in Health Service / Health Technician