Exprese a funkční analýza aspartyl-tRNA syntetázy rajčete

Bc. Pavla Svobodová

Diplomová práce

Expression and functional analysis of tomato aspartyl-tRNA ligase

Anotace:

Na rostliny působí velké množství stresových faktorů. V současné době se v rámci ochrany rostlin dostávají do popředí nové způsoby ochrany rostlin vycházející z použití látek schopných navodit stav zvýšené obranyschopnosti. Jednou z těchto látek je beta-aminomáselná kyselina (BABA) indukující rezistenci u řady rostlin proti široké škále stresových faktorů. BABA však kromě indukce rezistence způsobuje i inhibici růstu rostliny. Navržený molekulární mechanismus působení BABA předpokládá aktivaci dvou oddělených signálních drah po vazbě BABA do aktivního místa aspartyl-tRNA syntetázy místo přirozeného substrátu kyseliny L-asparagové. V této práci byl nejprve identifikován cílový gen pro aspartyl-tRNA syntetázu v rostlinách rajčete odpovídající genu pro aspartyl-tRNA syntetázu v rostlinách Arabidopsis thaliana. Tento gen byl amplifikován z cDNA získané reverzní transkripcí RNA z listů kultivaru rajčete Mikro-Tom. Následovalo štěpení restrikčními endonukleázami a vložení do vektoru pET32a. Poté byla provedena exprese aspartyl-tRNA syntetázy. Ukázalo se, že purifikace aspartyl-tRNA syntetázy nebyla úspěšná v dostatečné čistotě. Proto byl ve druhé části práce použit vektor pET28a, u kterého se purifikace ukázala mnohem efektivnější. V další části práce byly měřeny kinetické parametry aspartyl-tRNA syntetázy, které odpovídaly hodnotám jiné měřené aminoacyl-tRNA syntetázy. Měření kinetických parametrů v přítomnosti přirozeného substrátu kyseliny L-asparagové a BABA ukázalo, že inhibice navrženým mechanismem není pravděpodobná. Inhibice totiž nastala až po přidání pro rostlinu ne-fyziologicky vysoké koncentrace BABA.

Abstract:

Plants are exposed to a variety of stress factors. Today, in the field of plant protection new methods of plant protection based on the use of substances capable of inducing a state of enhanced defence are coming to the forefront. One of these substances is beta-aminobutyric acid (BABA) inducing resistance in a number of plants to a wide range of stress factors. However, in addition to inducing resistance, BABA also inhibits plant growth. The proposed molecular mechanism of BABA action suggests activation of two separate signalling pathways after BABA binding to the aspartyl-tRNA synthetase active site instead of the natural substrate, L-aspartic acid substrate. In this work, firstly the target gene for aspartyl tRNA synthetase in tomato plants corresponding to the gene for aspartyl tRNA synthetase in Arabidopsis thaliana plants was identified. This gene was amplified from cDNA obtained by reverse transcription of RNA from leaves of a tomato genotype Mikro-Tom. Consequently, restriction endonuclease digestion and cloning into the pET32a vector was done and aspartyl-tRNA synthetase was expressed. Because purification of aspartyl-tRNA synthetase was not in sufficient purity, in the second part of the work the vector pET28a was used. In this vector purification was much more effective. Within the next part of the thesis the kinetic parameters of aspartyl-tRNA synthetase were measured and they corresponded to the values of the other measured aminoacyl-tRNA synthetase. Measurement of kinetic parameters in the presence of the natural substrate L-aspartic acid and BABA showed that inhibition by the proposed mechanism is unlikely. Indeed, inhibition occurred only after the addition of a non-physiologically high concentration of BABA to the plant.

Klíčová slova

rezistence rostlin, indukovaná rezistence, beta-aminomáselná kyselina, aspartyl-tRNA syntetáza, pET32, pET28, exprese proteinu, měření kinetických parametrů

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 6. 1. 2020

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 6. 2. 2020
• Vedoucí: doc. Mgr. Jan Lochman, Ph.D.
• Oponent: Mgr. Kateřina Dadáková, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Analytická biochemie