Lokalizace a identifikace molekulárních cílů biologicky aktivních látek

Mgr. Jarmila STANKOVÁ

Doctoral thesis

Biologically Active Compounds´ Molecular Target Localization and Identification by Microscopic Methods

Abstract:

V předložené práci byly pomocí fluorescenční mikroskopie studovány dvě odlišné skupiny konjugátů biologicky aktivních látek s různými variantami BODIPY barviva. Studie rovněž zkoumala proveditelnost fenotypové testovací metody. Deriváty kyseliny betulinové (BA) byly testovány na buněčné linii U2OS. První skupina látek zahrnovala devět derivátů BA značených BODIPY-FL (konjugáty 1-9), a kontrolní konjugát sestávající pouze z linkeru a BODIPY-FL značky (konjugát 10). Po krátké inkubaci byla lokalizace těchto konjugátů pozorována v živých buňkách. Konjugát 2 vykazoval nejvyšší cytotoxicitu a rozdílný vzor barvení. Kombinace délky linkeru a struktury triterpenoidní části byly klíčové pro lokalizaci a cytotoxicitu konjugátů. Vizualizace konjugátů ve fixovaných buňkách a buněčných lyzátech naznačovala možnou kovalentní vazbu těchto derivátů na buněčné cíle. Druhá skupina látek obsahovala šest derivátů BA a bevirimatu značených BODIPY s modrou fluorescencí. Krátká inkubace ukázala lokalizaci konjugátů 11 a 16 v živých buňkách. Kolokalizační experimenty a analýzy prokázaly interakci převážně s endoplazmatickým retikulem a mitochondriemi, a význam přidané aminoskupiny. Druhá část práce se zaměřila na studium systému 3HQ-aminoBODIPY s OFF-ON efektem pro sledování uvolňování aktivní látky v buňkách. Disulfidový linker byl navržen pro řízené uvolňování léčiva v přítomnosti glutathionu. Experimenty s živými buňkami a fluorescenční mikroskopií potvrdily časově závislé uvolňování léčiva z konjugátů 17-20. Koncept trojdílných konjugátů 20 a 21 byl ověřen s využitím c(RGDfK) motivu a FRET, kde oba konjugáty aplikované na buňky HeLa vykázaly změnu fluorescence v reálném čase. Tato studie ukazuje možnosti vytvoření teranostických nástrojů vhodných pro personalizovanou medicínu. V poslední části práce byla provedena pokročilá analýza obrazového datasetu pořízeného digitálním fázovým kontrastem (DPC) a fluorescenční mikroskopií. Data byla analyzována programem Columbus a umělou inteligencí (AI) pomocí konvoluční neuronové sítě, což umožnilo klasifikaci inhibitorů topoizomerázy na buněčné linii U2OS s přesností až 99 %. Toto potvrzuje využitelnost DPC snímků pro klasifikaci pomocí AI a jejich aplikaci v identifikaci buněčných cílů a ve vývoji léčiv.

Abstract:

In this work, two distinct groups of conjugates of biologically active compounds with different variants of BODIPY dye were studied by fluorescent microscopy. Additionally, the research focused on a proof-of-concept study for the potential of a phenotypic screening method. Betulinic acid (BA) derivatives were tested on the U2OS cell line, where the first set of compounds included nine BA derivatives labeled with BODIPY-FL (conjugates 1-9), with a control conjugated containing only the linker and the BODIPY-FL label (conjugate 10). After a short incubation, these conjugates were localized in live cells. Conjugate 2 showed the highest cytotoxicity and a different staining pattern. The combination of the linker length and the triterpenoid moiety were crucial for the localization and the cytotoxicity of the conjugates. Visualization of the conjugates in fixed cells and cell lysates suggested possible covalent binding of the derivatives to cellular targets. The second set of compounds consisted of six BODIPY-labeled BA and bevirimat derivatives with blue fluorescence. A short incubation revealed the localization of conjugates 11 and 16 in living cells. Colocalization experiments showed interaction predominantly with the endoplasmic reticulum and mitochondria, emphasizing the importance of the added amino group. The second part of the work focused on the 3HQ-aminoBODIPY system with OFF-ON effect to monitor the release of the active drug in cells. A disulfide linker was designed to regulate drug release in the presence of glutathione. Experiments with live cells and fluorescence microscopy confirmed the time-dependent effect of drug release from conjugates 17-20. The concept of three-part conjugates 20 and 21 was validated using the c(RGDfK) motif and FRET, where both conjugates were applied to HeLa cells, and the change in fluorescence was observed in real-time. This study highlights the potential of creating theranostics tailored for personalized medicine. In the final section of the work, an advanced analysis of the image dataset acquired by digital phase contrast (DPC) and fluorescence microscopy was performed. The data was analyzed by the commercial program Columbus and artificial intelligence (AI) using a convolutional neural network, allowing classification of topoisomerase inhibitors on the U2OS cell line with an accuracy up to 99%. This confirms the utility of DPC images for AI classification and their application in cell target identification and drug development.

Keywords

mikroskopie, lokalizace cíle, identifikace cíle, BODIPY, betulinová kyselina, 3HQ, digitální fázový kontrast

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 1. 2023

Thesis defence

• Supervisor: MUDr. Petr Džubák, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Medicine and Dentistry

Doctoral programme / field:
Pediatrics / Pediatrics