Příprava konstruktu YFP-OMTK1 a jeho testování metodou transientní transformace listů Nicotiana benthamiana

Adam MASOPUST

Bachelor's thesis

Preparation of the YFP-OMTK1 construct and its testing by the method of transient transformation of \kur{Nicotiana benthamiana\kur{}} leaves

Abstract:

Tato bakalářská práce je zaměřena na přípravu konstruktu exprimujícího fúzní protein YFP-OMTK1 pod kontrolou konstitutivního promotoru. Gen OMTK1 byl objeven v tolici vojtěšce (Medicago sativa), která je využívána jako krmivo pro hospodářská zvířata. Tento gen patří mezi MAPKKK a je spojen s reakcí na stres vyvolanou peroxidem vodíku. Literární rešerše je zaměřena na obecnou charakterizaci mitogenem aktivovaných protein kináz (MAPK), na komplexní signalizační kaskády v rostlinách v reakci na patogeny, abiotický stres, růst a vývin rostlin, v nichž jsou MAPK zapojeny. Následně je práce zaměřena na vybrané MAPK z M. sativa a princip Gateway klonování, který byl využit při klonování konstruktu pro expresi fúzního proteinu. V rámci experimentální části bakalářské práce byla nejdříve získána sekvence genu OMTK1, dle které byly navrhnuty specifické primery. Technikou MultiSite Gateway klonování byl následně připraven konstrukt AtUBQ10::YFP:cOMTK1. Metodou transientní transformace listů rostliny N. benthamiana bylo zjištěno, že protein OMTK1 je lokalizován v cytoplazmatické membráně. Následně byla metodou nativní PAGE a Western blot ověřena exprese fúzního proteinu. Taktéž bylo potvrzeno možné zapojení genu OMTK1 v programované buněčné smrti pozorováním fenotypu listů rostliny N. benthamiana, ve výše zmíněném experimentu.

Abstract:

This bachelor thesis focuses on the preparation of a construct expressing the YFP-OMTK1 fusion protein under the control of a constitutive promoter. The OMTK1 gene was discovered in alfalfa (Medicago sativa), which is used as a livestock feed. The OMTK1 gene belongs to the MAPKKK family and is associated with the response to hydrogen peroxide-induced stress. The literary research is focused on the general characterization of mitogen-activated protein kinases (MAPKs), on the complex signaling cascades in plants in response to pathogens, abiotic stress, and plant growth and development in which MAPKs are involved. The theoretical overview is also focused on MAPKs from M. sativa and the principle of Gateway cloning that was used to clone a construct for fusion protein expression. In the experimental part of the bachelor thesis, the sequence of the OMTK1 gene was first obtained, according to which the specific primers were designed. Then, the construct AtUBQ10::YFP:cOMTK1 was prepared by the MultiSite Gateway cloning technique. The OMTK1 protein was found to be localized in the cytoplasmic membrane by transient transformation of the N. benthamiana leaves. Subsequently, the expression of the fusion protein was verified by native PAGE and Western blot. The possible involvement of the OMTK1 gene in programmed cell death was confirmed by observing the phenotype of N. benthamiana in the aforementioned experiment.

Keywords

Medicago sativa, MAPK, OMTK1, MultiSite Gateway klonování

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 3. 5. 2024

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Ivan Luptovčiak, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Molecular and Cell Biology / Molecular and Cell Biology