Stanovení vybraných vitaminů skupiny B v mléce metodou HPLC

Bc. Jaroslav Valenta

Master's thesis

Determination of selected B group vitamins in milk using HPLC

Abstract:

Vitaminy rozpustné ve vodě jsou pestrou skupinou biologicky aktivních látek různé chemické povahy zahrnující thiamin (B1), riboflavin (B2), niacin (B3), kyselinu pantothenovou (B5), pyridoxin (B6), biotin (B7), kyselinu listovou (B9), kobalamin (12) a vitamin C. Většina ve vodě rozpustných vitaminů zaujímá roli koenzymů důležitých enzymů. Hydrofilní vitaminy je nutné neustále doplňovat stravou. Mléko a mléčné výrobky jsou oblíbenou a výživnou součástí jídelníčku a klíčovou potravinou živočišného původu v dětském věku. Mléko je také významným zdrojem některých vitaminů. Některé vitaminy rozpustné ve vodě jsou v mléce v nízkých koncentracích, řada z nich je termolabilní a fotosenzitivní, a tak bývá stanovení jejich obsahu složité. Vhodným způsobem jejich kvantifikace je vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC). V současně době jen velmi málo původních prací pojednávajících o této problematice. V rámci diplomové práce bylo zavedeno simultánní stanovení vitaminů B1, B2, B3, B6, B9 a C v různých druzích mléka metodou HPLC. Optimalizace metodiky přípravy byla realizována na 140 vzorcích. U poloviny vzorků byl použit enzym takadiastáza, který uvolňuje vázané formy vitaminů. Vhodnost jeho použití byla statisticky prokázána. Součástí manipulace se vzorky bylo jejich důkladné odstínění pro ochranu fotosenzitivních vitaminů (B2, B6, B9). Pro analýzu vzorků byla použita kolona s pevným jádrem Kinetex 2,6 μm Polar C18 (100 x 4,6 mm, 100 Å), kdy separace jednotlivých vitaminů, jejich detekce a kvantifikace byla přesně podle postupu vyvinutého firmou Phenomenex. Analyzovány byly vzorky různých typů kravského, ovčího a kozího mléka. Jednalo se vzorky čerstvého a tepelně ošetřené. Kvantifikace obsahu vitaminů B1 a B9 nebyla uspokojivě provedena, neboť téměř ve všech vzorcích byly jejich obsahy pod mezí detekce. Statisticky významný rozdíl v obsahu vitaminů byl stanoven u ovčího mléka oproti kravskému a kozímu. Výsledky obsahu vitaminů pro ostatní posuzované vztahy naznačují určité trendy a je potřeba je brát pouze jako orientační, avšak zasluhují pozornost pro další práce. Metodou HPLC se povedlo stanovit obsah většiny vitaminů, je však nutné pokračovat v optimalizaci i při přípravě vzorků.

Abstract:

The Water-soluble vitamins (WSV) are a diverse group of biologically active substances of different chemical natures, including thiamine (B1), riboflavin (B2), niacin (B3), pantothenic acid (B5), pyridoxine (B6), biotin (B7), folate (B9), cobalamin (12) and vitamin C. Most of the water-soluble vitamins takes act as coenzymes of important enzymes. Hydrophilic vitamins need to be continuously supplemented through diet. Dairy and dairy products are popular and a nutritious part of diet and a key animal source food in childhood. Milk is also an important source of several vitamins. Some WSV are present in milk in low concentration and many of them are thermolabile and photosensitive, so it is often complicated to determine their content. A suitable way of their quantitation is high-performance liquid chromatography (HPLC). Currently, there are very few original works dealing with this issue.Within the thesis, a simultaneous determination of B1, B2, B3, B6, B9 and C vitamin content in different kinds of milk was implemented through the HPLC method. Optimization of the preparation methodology was carried out on 140 samples. On half of the samples, a takadiastase enzyme was used, as it releases bound forms of vitamins. The suitability of its use has been statistically proven. Part of the manipulation with samples was their thorough shielding, in order to protect photosensitive vitamins (B2, B6, B9). For the analysis of the samples, a core-shell column Kinetex 2,6 μm Polar C18 (100 x 4,6 mm, 100 Å) was used, where the separation of each vitamin, their detection, as well as quantification, was conducted in the exact accordance with the procedure developed by the Phenomenex company. The analysis was performed on samples of different kinds of cow, sheep and goat milk. These were always fresh and heat-treated samples. The quantification of both B1 and B9 vitamin content was not satisfactory, because in almost all analyzed samples, their concentration was below the limit of detection. Statistically significant difference in the vitamin content was determined for sheep milk, in comparison with both cow and goat milk. Vitamin content results for other relations considered suggest some trends and they need to be taken only as tentative, although, they deserve attention for future works. Through the HPLC method, it was possible to determine the content of most vitamins, nevertheless, it is necessary to continue with optimization even during the samples preparation.

Keywords

pyridoxin, HPLC, mléko, thiamin, niacin, listová kyselina, riboflavin

Keywords

milk, thiamine, riboflavin, niacin, pyridoxine, folate, HPLC

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 4. 2018

Thesis defence

• Supervisor: doc. Ing. Alena Hejtmánková, CSc.
• Reader: Jana Dolejšková, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Animal Science / Animal Science