Funkční význam druhého alfa-helixového svazku membránových PIN proteinů

Bc. Veronika Bilanovičová

Diplomová práce

Functional significance of the second alpha-helical bundle of PM PINs

Anotace:

PIN proteiny hrají důležitou roli při vývoji rostlin. Přenosem auxinu přispívají k polárnímu toku tohoto fytohormonu, což vede k jeho akumulaci v místech, kde jsou zahájeny a následně kontrolovány procesy vývoje rostliny. PIN proteiny jsou z hlediska buněčné biologie a fyziologie zeširoka studovanými molekulami, ale funkce jejich jednotlivých domén dosud nebyla dostatečně charakterizována. Proteinová rodina PIN FORMED sestává z 8 členů: PIN1-4 a PIN7, takzvané dlouhé PINy nesoucí dlouhou hydrofilní smyčku, a PIN5, který má naopak smyčku velmi krátkou. PIN6 protein obsahuje smyčku o průměrné délce. Ananalýzou topologie dlouhých PIN proteinů lokalizovaných na cytoplazmatické membráně bylo prokázáno, že jsou tvořeny dvěma svazky transmembránových domén (TMDs) propojenými dlouhou hydrofilní smyčkou (TMDs 1-5-smyčka-TMDs 6-10). Procesy exprese a purifikace membránových proteinů jsou složité, a proto pravděpodobně nebyly PIN proteiny, kromě nedávných topologických studií, doposud charakterizovány. V této práci jsme se zaměřili na dva hlavní projekty: expresi, purifikaci a počáteční strukturní charakterizaci dlouhé hydrofilní smyčky proteinu PIN1 a funkční analýzu druhého svazku transmembránových domén. Optimalizovali jsme protokoly umožňující exprimovat a purifikovat hydrofilní smyčku v dostatečném množství a čistotě, díky čemuž mohla být provedena strukturní analýza a lze optimisticky vzhlížet k budoucí detailnější strukturní NMR analýze. Dále jsme experimentálně prokázali, že HS obsahuje strukturované oblasti a není pouze spojníkem transmembránových domén. Tato povzbudivá počáteční data umožňují následnou detailní analýzu, která by mohla srozumitelněji vyjádřit vztah mezi strukturou a funkcí hydrofilní smyčky PIN1 proteinu. V neposlední řadě jsme demonstrovali rozdíly mezi imunobarvením C-konce a hydrofilní smyčky PIN1, které byly obzvláště nápadné po aplikaci látek ovlivňujících množství auxinu v kořeni. Naše počáteční výsledky zprostředkovávají buněčnou charakterizaci domén PIN proteinu po odštěpení druhého svazku alfa helixů (TMDs 6-10) od hydrofilní smyčky a zbytku PIN proteinu. Tyto výsledky napovídají, že druhý svazek helixů je za určitých podmínek fyzicky oddělen od zbytku proteinu a prostřednictvím nitrobuněčného transportního aparátu je nezávisle zpracováván, což naznačuje další možný funkční rozdíl mezi prvním a druhým svazkem helixů. Všechny tyto zajímavé spekulace je nutno v co nejbližší době detailněji experimentálně ověřit.

Abstract:

PIN proteins play important roles during plant ontogenesis. They transport auxin contributing to the directional flow of this phytohormone ultimately leading to the creation of accumulation patterns of auxin necessary for initiating and controlling plant developmental programs. Even though, in terms of cell biology and physiology PINs are widely studied, the function of particular domains is still insufficiently characterized. The PIN FORMED protein family consists of 8 members: PIN1-4 and PIN7 are so called long PINs, containing a long hydrophilic loop (HL) while PIN5, 8 poses a very short loop. PIN6 has a loop of intermediate size. The topology determination experiments have shown the cytoplasmic localization of the large loop that is connecting two bundles of 5 transmembrane domains (TMDs; TMDs1-5-loop- TMDs 6-10) present in the so called long, PM localized PINs. Beside the quite recent topological studies PINs were not structurally characterized until now, probably due to the difficulty in expression and purification of PM proteins. In this thesis we focused on two main projects: expression, purification and initial structural characterization of PIN1 hydrophilic loop (HL) and functional characterization of second bundle of TM domains. We have optimized the protocols enabling us to express and purify HL in sufficient yield and purity for initial structural characterization and giving an encouraging outlook for the future more detailed structural NMR study. In addition, we have experimentally shown that HL contains structured regions and is not a merely unstructured linker of transmembrane domains. Those initial structural data encourage and enable further, more detailed, investigation that hopefully will delineate in more detail the structure-function relationship of PIN1 HL. We also demonstrated differences in immunostaining of the C-terminus versus the HL of PIN1 that are even more prominent after treatments that modify auxin levels in the root. Our initial results provide a cell biological characterization of PIN domains dissecting the second bundle of alpha helices (TMDs 6-10) from the hydrophilic loop and rest of the PIN1 protein. Those results hint that in some circumstances the second bundle of helices is physically separated from the rest of the protein and is trafficked independently via the subcellular transport machinery. This further implies possible functional differentiation between the first and second helical bundle. Those are very interesting speculations that need to be more strongly experimentally verified in very near future.

Keywords

PIN1, hydrofilní smyčka, purifikace, imunolokalizace, druhý transmembranový svazek, hydrophilic loop, purification, immunolocalization, second transmembrane bundle

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 16. 5. 2018

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 7. 6. 2018
• Vedoucí: B.A. Tomasz Nodzynski, M.Sc.
• Oponent: M.Sc. Agnieszka Szmitkowska

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie