Klonování, exprese a purifikace AMP-deaminasy z kvasinek

Bc. Vendula KAJNAROVÁ

Diplomová práce

Cloning, expresion and purification of AMP deaminase from yeasts

Anotace:

Díky genetickému a proteinovému inženýrství, které využívají rekombinantní technologie je dnes možné produkovat komerčně významné proteiny. Tyto proteiny jsou poté využívány v různých oblastech průmyslu, medicíny a zemědělství. AMP-deaminasa je enzym s homotetramerní strukturou, katalyzující hydrolýzu adenosinmonofosfátu na inosinmonofosfát a amoniak. Je jedním z klíčových enzymů regulace hladin purinových nukleotidů. V součastnosti je spousta nově vyvíjených léčiv syntetizována na bázi purinů. Některé syntetické deriváty cytokininů (N6-substituované deriváty adeninu) jsou specifickými inhibitory regulačních proteinů buněčného cyklu. Příkladem je olomoucin, roskovitin nebo bohemin, které mají protinádorové účinky a jsou využívány jako léčiva proti rakovině. Vzhledem k podobnosti kvasinkové a savčí AMP-deaminasy by bylo možné získat základní data o tom, zda tento enzym má schopnost tato léčiva odbourávat či ne. Bylo prokázáno, že lidská adenosindeaminasa některá tato léčiva odbourává. Tyto znalosti by mohly sloužit k přípravě derivátů léčiv, které by touto skupinou enzymů degradovány nebyly. Tato diplomová práce navazuje na bakalářskou práci ?Příprava plazmidových konstruktů pro integraci AMP-deaminasy do kvasinek?, kde byly připraveny tři plazmidové konstrukty s geny AMP-deaminas pro vnesení do kvasinek Saccharomyces cerevisiae nebo Pichia pastoris. Jedná se o konstrukty pDR197 s genem AMD1 pro kultivaci a expresi v S. cerevisiae, pGAPZ? A s genem SPBC106.04 a pPICZ A taktéž s genem SPBC106.04 pro kultivaci a expresi v P. pastoris. Gen AMD1 pochází z S. cerevisiae, gen SPBC106.04 z S. pombe. V experimentální části této práce byla zkoumána integrace výše zmíněných genů AMP-deaminas do uvedených kvasinek, exprese AMP-deaminasy v kvasinkách a relativní specifická aktivita daného proteinu v hrubém lyzátu buněk.

Abstract:

Thanks to the genetic and protein engineering that use the recombinant technology, production of commercially important proteins is now possible. These proteins are then used in various industrial areas, medicine and agriculture. AMP-deaminase is an enzyme with homotetramer structure which specifically catalyzes the hydrolysis of adenosine monophosphate to products inosin monophosphate and ammonia. It is one of the key enzymes regulating the levels of purine nucleotides. In these days, synthesis of many novel drugs is derived from structure of purines. Some synthetic derivatives of cytokinins (N6-substituted adenine derivatives) are specific inhibitors of cell cycle regulatory proteins. An example is olomoucine, roscovitine or bohemine that have anticancer effects and that are used as drugs against cancer. Given the similarity between yeast and mammalian AMP deaminase, basic data on whether this enzyme has the ability to degrade these drugs or not could be obtained. It has been shown that human adenosin deaminase degrades some of these drugs. This knowledge could be used for preparation of suitable drug derivatives. This diploma work is based on bachelor thesis, "Preparation of plasmid constructs for the integration of AMP deaminase in yeast", where were prepared three plasmid constructs with AMP deaminase genes for insertion into the yeast Saccharomyces cerevisiae or Pichia pastoris. It is construct pDR197 with gene AMD1 for cultivation and expression in S. cerevisiae, pGAPZ? A with gene SPBC106.04 and pPICZ A also with gene SPBC106.04 for cultivation and expression in P. pastoris. AMD1 gene originates from S. cerevisiae, SPBC106.04 gene originates from S. pombe. In the experimental part of this work, integration of the above mentioned AMP deaminase genes in these yeast, expression of AMP deaminase in yeast and the relative specific activity of the protein in crude cell lysate were studied.

Klíčová slova

AMP-deaminasa, P. pastoris, S. cerevisiae, S. pombe, rekombinantní protein

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 23. 4. 2012

Zveřejnit od: 23. 4. 2012

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Mgr. Hana Pospíšilová, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie