Elektrochemická detekce jednořetězcových úseků získaných pomocí terminální transferázy v kružnicové a lineární DNA.

Mgr. Jana ŠIROKÁ

Master's thesis

Electrochemical detection of single-stranded tracts synthetized by means of terminal transferase in circle and linear DNA molecules.

Abstract:

Terminální deoxynukleotidyltransferáza nachází využití v biochemii při značení 3?-konců nukleových kyselin. Uplatňuje se zejména při detekci apoptózy. Během apoptózy dochází k fragmentaci DNA endonukleázami za vzniku volných konců. Na 3?OH skupinu těchto volných konců může TdT katalyzovat přidávání deoxyribonukleotidů z deoxyribonukleotid trifosfátů. Rozšířenou metodou značení volných konců je TUNEL test založený na schopnosti TdT inkorporovat biotinylovaný dUMP na 3? konec DNA, která se vyskytuje v místech zlomů. Inkorporovaný dUMP je vizualizován fluorescenčně, pomocí fluorescenčního mikroskopu. Dalšími využívanými metodami detekce jsou například průtoková cytometrie nebo imunochemické značení pomocí protilátek. Elektrochemická detekce je další možnou variantou detekce aktivity terminální deoxynukleotidyltransferázy. Pomocí citlivých voltametrických metod lze zjistit poměrně malé strukturní změny v DNA, ale také změnu koncentrace některých nukleotidů a jejich derivátů inkorporovaných do polynukleotidového řetězce. V této práci byla využita k detekci prodloužených 3?-konců metoda square wave voltametrie a cyklická voltametrie.

Abstract:

Terminal deoxynucleotidyltransferase is used in biochemistry for labeling of 3?-ends of nucleic acids. It is used to detect apoptosis. During apoptosis fragmentation of DNA by endonucleases occures, that is connected with creation of free ends. Addition of deoxyribonucleotides on 3'OH group of these free ends could be catalyzed by TdT. TUNEL assay, a common method for labeling free ends is based on the ability of the TdT incorporate biotinylated dUMP at the 3-'end of DNA, which occurs in the brakes sites. Incorporated dUMP is visualized by fluorescence using flourescence microscope. Other detection methods are for example flow cytometry or immunochemical labeling with antibodies. Electrochemical detection is another possible way of detection terminal deoxynucleotidyltransferase activity. Sensitive voltammetric methods can detect relatively small structural changes in DNA, but also changes in the concentrations of some nucleotides and their derivatives incorporated in polynucleotidyl chain. In this work was used method of square wave voltammetry and cyclic voltammetry to detect the extended 3'-ends.

Keywords

terminální deoxynukleotidyltransferáza, elektrochemie nukleových kyselin, square wave voltametrie, cyklická voltametrie

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 17. 6. 2011

Accessible from:: 17. 6. 2011

Thesis defence

• Date of defence: 23. 8. 2011
• Supervisor: RNDr. Petr Pečinka, Ph.D.

University of Ostrava

Faculty of Science

Master programme / field:
Applied Physics / Biophysics