Kvantitatívne analýzy voľnej fetálnej DNA v plazme tehotných žien s využitím digitálnej PCR

Bc. Júlia HURNÍKOVÁ

Master's thesis

Quantitative analyses of free fetal DNA in maternal plasma by means of digital PCR

Abstract:

Diplomová práca bola zameraná na optimalizáciu krokov, ktoré predchádzajú analýze voľnej fetálnej DNA v rámci prenatálnej diagnostiky. Cieľom práce bolo otestovať dva izolačné postupy a tri rôzne metódy obohatenia voľnej fetálnej DNA, za účelom získania čo najvyššieho výťažku fetálnej frakcie. Dostatočný podiel fetálnej frakcie je kľúčový pri neinvazívnom prenatálnom testovaní, ktoré využíva ako vstupný biologický materiál krvnú plazmu matky. V experimentálnej časti predloženej diplomovej práce bola analyzovaná voľná bunková DNA celkom z 50 vzoriek krvnej plazmy tehotných žien. Izolovaná DNA bola ďalej upravovaná metódami pre zvýšenie výťažku voľnej fetálnej DNA. Prvou obohacovacou metódou bola gélová elektroforéza, druhou metódou bola separácia na magnetických guľôčkach a treťou testovanou metódou bola amplifikácia vybranej dĺžky fragmentov. Výsledky všetkých postupov boli analyzované s použitím digitálnej kvapôčkovej polymerázovej reťazovej reakcie. Najlepšie výsledky boli dosiahnuté použitím obohacovacej metódy založenej na separácii na magnetických guľôčkach. Priemerný výťažok fetálnej frakcie bol 9,89 %, čo bolo o 2,42 % viac ako vo vzorkách bez obohatenia. Druhou najsľubnejšou metódou bolo obohatenie na základe gélovej elektroforézy, kde bola dosiahnutá priemerná fetálna frakcia 8,54 %. Obohatenie pomocou amplifikácie vybranej dĺžky fragmentov bolo vyhodnotené ako nevyhovujúce kvôli vysokým smerodajným odchýlkam medzi jednotlivými vzorkami a nízkemu množstvu molekúl fetálneho pôvodu. Obohacovacia metóda využívajúca separáciu na magnetických guľôčkach je podľa výsledkov práce vhodná na úpravu vzoriek izolovanej voľnej bunkovej DNA pre následnú neinvazívnu prenatálnu diagnostiku a predstavuje vhodný diagnostický nástroj pre použitie v klinickej praxi.

Abstract:

The master thesis was focused on the optimization of the steps that precede the analysis of free fetal DNA in the prenatal diagnosis. The work aimed to test two isolation approaches and three different methods of free fetal DNA enrichment, to obtain the highest possible yield of fetal fraction. Sufficient fetal fraction is crucial in non-invasive prenatal testing, which uses maternal blood plasma as biological material. In the experimental part of the presented master thesis, cell free DNA was analyzed from 50 blood plasma samples of pregnant women. The isolated DNA was further modified to increase the yield of free fetal DNA. The first enrichment method was gel electrophoresis, the second method was magnetic bead separation, and the third method tested was the amplification of a selected fragment length. The results of all procedures were analyzed using a digital droplet polymerase chain reaction. The best results were obtained using the enrichment method based on separation on magnetic beads. The average yield of the fetal fraction was 9.89%, which was 2.42% more than in the samples without enrichment. The second most promising method was enrichment based on gel electrophoresis, where an average fetal fraction of 8.54% was achieved. Enrichment by amplification of a selected fragment length was evaluated as unsatisfactory due to high standard deviations between samples and a low number of molecules of fetal origin. According to the results of the work, the enrichment method using separation on magnetic beads is suitable for the preparation of cell free DNA isolated for subsequent non-invasive prenatal diagnosis and represents a suitable diagnostic tool for use in clinical practice.

Keywords

cffDNA, NIPT, ddPCR, obohatenie cffDNA, kvantifikácia fetálnej frakcie

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 29. 4. 2021

Thesis defence

• Supervisor: doc. Mgr. Radek Vodička, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Molecular and Cell Biology