Diferenční gelová elektroforéza (2-D DIGE) a její využití v onkologické proteomice

Mgr. Dominika Váňová

Bachelor's thesis

Differential gel electrophoresis (2-D DIGE) and its application in oncological proteomics

Abstract:

2-D DIGE je metodou značení komplexních proteinových směsí fluorescenčními barvami před jejich následnou separací pomocí dvourozměrné gelové elektroforézy, usnadňující detekci a kvantifikaci separovaných proteinů. Tato technologie byla aplikována na membránové frakce buněk HFs a CARs infikovaných čtyřmi různými viry a virovými vektory (HCMV Merlin, RCMV 1149 (ΔUL141), RAd587 (UL141), RAd592 (CTRL)), které se lišily v obsahu genu UL141. Jednotlivé proteinové vzorky byly označeny kyanidovými barvami (Cy2, Cy3 a Cy5), smíchány dohromady a separovány na 2-DE gelech. Směsné vzorky značené barvou Cy2 byly použity jako tzv. interní standardy. Po 2-DE byl každý vzorek zvlášť naskenován a vizualizován díky rozdílným excitačním a emisním vlnovým délkám kyanidových barev. Pomocí speciálního počítačového programu PDQUEST byly dále identifikovány rozdíly v proteinové expresi mezi jednotlivými vzorky. Pozornost při tom byla zaměřena na membránové proteiny CD155 a CD112, jejichž povrchová exprese v buňkách je ovlivňována proteinem gpUL141 kódovaným HCMV modulačním genem UL141. Gen UL141 zprostředkovává únik HCMV infikovaných buněk před zabitím ze strany NK buněk tím, že blokuje povrchovou expresi ligandů pro NK aktivační receptory. Hledané ligandy však nebyly nalezeny. Pomocí MS analýzy byl identifikován pouze Hsp27, který však s největší pravděpodobností neměl žádnou souvislost s genem UL141.

Abstract:

2-D DIGE is a method for labelling complex protein mixture with fluorescent dyes prior to their subsequent two-dimensional gel electrophoresis separation, which simplifies the process of detecting and quantifying separated proteins. This technique was applied to membrane fractions from HFs and CARs cells infected by four viruses and viral vectors (HCMV Merlin, RCMV 1149 (ΔUL141), RAd587 (UL141), RAd592 (CTRL)), that differed in gene UL141. Individual protein samples were labeled by cyanine dyes (Cy2, Cy3 and Cy5), mixed together and separated on 2-DE gels. Mixed samples labeled by Cy2 served as internal standard. After 2-DE protein separation, each of the gel was scanned and visualized independently by selecting the individual excitation and emission wavelengths for each cyanine dye. Differences in protein expression between samples were identified by using PDQUEST software. Our effort was particularly focused on detection of two membrane proteins, CD155 and CD112. Their surface expression is known to be influenced by a protein gpUL141, which is encoded by HCMV modulation gene UL141. Gene UL141 mediates an evasion of NK cell killing the HCMV infected cells by blocking surface expression of ligands for NK cell-activating receptors. However, the ligands CD155 and CD112 were not detected using this approach. Hsp27 was identified between differentially expressed protein, however, seems not to be functionally linked with UL141.

Keywords

2-D DIGE, 2-DE, lidský cytomegalovirus, CD155, CD112, UL141, modulace imunitního systému hostitele

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 5. 2009

Thesis defence

• Date of defence: 16. 6. 2009
• Supervisor: doc. Mgr. Pavel Bouchal, Ph.D.
• Reader: Mgr. Jitka Holčáková, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry