Modulace účinků ionizujícího záření radioprotektivními a radiosenzitivizujícími látkami

Bc. Adéla Kmochová

Diplomová práce

Modulation of ionizing radiation effects by radioprotective and radiosenzitising agents

Anotace:

CÍL: Cílem naší práce bylo vyhodnotit vliv specifických inhibitorů PI-3 kináz, konkrétně inhibitoru DNA-dependentní protein kinázy (DNA-PK) NU7441, ATM kinázy KU55933 a ATR kinázy VE821 a radioprotektivní látky Gamafos na účinky ionizujícího záření. MATERIÁL A METODY: Separované periferní lidské lymfocyty byly pro experimentální část práce rozděleny do 6 skupin: negativní kontrola (neozářená), pozitivní kontrola (pouze ozářená) a 4 skupiny ovlivněné inhibitory KU55933 (10 mikro M), NU7441 (1 mikro M), VE821 (10 mikro M) a radioprotektivní látkou Gamafos (40 mikro M) a následně ozářené. Tyto látky byly podány 30 minut před ozářením dávkou 2 Gy z 60Co zdroje gama záření (vzdálenost 1 m, dávkový příkon 0,54- 0,52 Gy/min). Vliv výše zmíněných látek byl hodnocen pomocí metody průtokové cytometrie (fosforylace histonu H2AX v 0,5hodinovém intervalu po ozáření a apoptotest měřený v 24hodinovém intervalu po ozáření) a pomocí analýzy mikrojader. VÝSLEDKY: Po ozáření (pozitivní kontrola) byl v porovnání s negativní kontrolou pozorován nárůst fosforylace H2AX (2,5×), zvýšení množství mikrojader v dvoujaderných buňkách (40,1×) a vyšší zastoupení časně a pozdně apoptotických buněk (2× respektive 2,5×). Ve srovnání s pozitivní kontrolou, KU55933 vyvolal 44,7% pokles fosforylace H2AX (statisticky na úroveň negativní kontroly), neovlivnil genotoxicitu záření a vyvolal 26,5% pokles časně apoptotických buněk. NU7441 nevykazoval efekt stran fosforylace H2AX, na druhou stranu zvýšil množství mikrojader a nukleoplazmatických v dvoujaderných buňkách (2,3× respektive 4,7×) a zastoupení časně a pozdně apoptotických buněk (1,2× respektive 1,7×). Inhibitor VE821 vedl pouze k mírnému 18,4% poklesu fosforylace H2AX. Genotoxicitu záření ani zastoupení časně a pozdně apoptotických buněk VE821 neovlivnil. Gamafos nevykázal vliv na fosforylaci H2AX ani nemodifikoval genotoxické účinky ionizujícího záření, vyvolal však významný vzestup časně a pozdně apoptotických buněk (1,6× respektive 2,6×). ZÁVĚR: Použitím inhibitorů PI-3 kináz je možné účinky ionizujícího záření modulovat. Zatímco inhibice DNA-PK nenarušuje u lidských periferních lymfocytů fosforylaci H2AX, použití NU7441 významně zesiluje genotoxicitu a cytotoxicitu ionizujícího záření. S fosforylací H2AX u lymfocytů nejefektivněji interferuje inhibitor ATM kinázy KU55933, který zároveň redukuje indukci apoptózy. Inhibice ATR kinázy vyvolá pouze mírný pokles fosforylace H2AX. Gamafos u separovaných periferních lymfocytů radioprotektivní vlastnosti nevykazuje. Naopak zesiluje cytotoxické účinky ionizujícího záření.

Abstract:

BACKGROUND: The aim of our study was to evaluate the impact of three specific PI-3 kinase inhibitors - DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) inhibitor NU7441, ATM kinase inhibitor KU55933, and ATR kinase inhibitor VE821 and one radioprotective substance Gamafos on the ionizing radiation effects. METHODS: For the experimental part of our work, the separated human peripheral lymphocytes were divided into 6 groups: negative control (non-irradiated), positive control (irradiated only) and 4 groups treated with KU55933 (10 mikro M), NU7441 (1 mikro M), VE821 (10 mikro M), or Gamafos (40 mikro M) and irradiated. The substances were added to lymphocyte cultures 30 minutes before irradiation by the dose of 2 Gy (60Co gamma radiation source, at a dose rate of 0.54 - 0.52 Gy/min Gy min-1 with a target distance of 1 m). We used flow cytometry method to evaluate phosphorylation of histone H2AX 0.5 h after irradiation. Cytotoxicity was measured using apoptest in the 24 h interval. Finally, micronucleus assay was used to assess genotoxicity. RESULTS: After irradiation (positive control), we observed increased H2AX phosphorylation (2.5fold), increased frequency of micronuclei in binuclear cells (40.1fold) and higher proportion of early and late apoptotic cells (2- and 2,5fold, respectively) when compared to negative control group. In comparison with positive control, KU55933 caused 44.7% decrease in H2AX phosphorylation statistically reaching the level measured in non-irradiated group. KU55933 did not affect ionising radiation-induced genotoxicity and reduced amount of early apoptotic cells by 26.5%. NU7441 showed no effect on H2AX phosphorylation. On the other hand, it increased the number of micronuclei and nucleoplasmatic bridges in binuclear cells (2.3- and 4.7fold, respectively) and the amount of early and late apoptotic cells (1.2- and 1.7fold, respectively). Inhibitor VE821 decreased phosphorylation of H2AX by 18.4%, while it did not affect radiation-induced genotoxicity and the proportion of early and late apoptotic cells. Finally, Gamafos showed no effect on the phosphorylation of H2AX nor modified genotoxic effects of ionizing radiation. However, it caused a significant increase in early as well as late apoptotic cells (1.6-, 2.6fold, respctively). CONCLUSION: PI-3 kinase inhibitors modulate the effects of ionizing radiation in separated peripheral human lymphocytes. While the DNA-PK inhibition does not seem to interfere with H2AX phosphorylation, the use of NU7441 significantly enhanced both radiation-induced genotoxicity and cytotoxicity. H2AX phosphorylation was most effectively disrupted by the ATM kinase inhibitor KU55933, which also reduced ionizing radiation-induced apoptosis. Inhibition of ATR kinase caused only a slight decrease in H2AX phosphorylation. Gamafos does not possess any radioprotective properties in separated peripheral lymphocytes. On the contrary, it increases ionizing radiation cytotoxic effects.

Klíčová slova

ionizující záření, H2AX, DNA-PK, ATM kináza, ATR kináza, inhibitor NU7441, inhibitor KU55933, inhibitor VE821, Gamafos (Amifostin), analýza mikrojader, apoptotest

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 15. 5. 2013

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 5. 6. 2013
• Vedoucí: MUDr. Jaroslav Pejchal, Ph.D.

Univerzita Pardubice

Fakulta chemicko-technologická

Magisterský studijní program / obor:
Speciální chemicko-biologické obory / Analýza biologických materiálů