Mechanisms of carcinogenesis and endocrine disruption after exposure to enviromental polyaromatic contaminants

Mgr. Pavlína Šimečková, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Nedioxinové polychlorované bifenyly (NDL-PCB) jsou obtížně odbouratelné kontaminanty životního prostředí, které se hromadí v potravním řetězci. Jedním z jejich známých toxických efektů je akutní inhibice mezibuněčné komunikace zprostředkované mezerovými spoji (gap junctional intercellular commmunication GJIC), což je děj, který může souviset s nádorovou promocí. Nejvýznamnější zástupce NDL-PCB - 2,2',4,4',5,5'-hexachlórbifenyl (PCB 153) v předchozích studiích dlouhodobě inhiboval GJIC v krysích jaterních epiteliálních buňkách WB-F344. Protože tento efekt může být způsoben narušením syntézy, transportu nebo degradace konexinu 43 (Cx43), zkoumali jsme účinek PCB 153 na tyto děje. PCB 153 neměl žádný vliv na hladinu mRNA proteinu Cx43, ale navodil postupnou ztrátu tohoto proteinu a významně snížil množství gap junction (GJ) plaků v plazmatické membráně. PCB 153 také indukoval akumulaci hyperfosforylované formy Cx43 závislé na aktivaci ERK1/2 (extracelulárním signálem regulované kinázy 1/2), což naznačuje, že tento mechanismus může být zapojen ve zvýšené internalizaci a degradaci Cx43 po působení PCB 153. Za použití specifických inhibitorů proteasomální a lysosomální degradace jsme zjistili, že oba tyto typy degradace jsou zapojeny v internalizaci a odbourávání Cx43 po PCB 153. Ani jeden z inhibitorů ale nedokázal obnovit GJIC nebo velikost a množství GJ plaků. Dále jsme analyzovali efekt PCB 153 na proteiny adherentních spojů (adherens junction AJ). PCB 153 indukoval postupnou degradaci proteinů E-kadherinu, β-kateninu a plakoglobinu (γ-kateninu), ale neměnilo hladinu jejich mRNA. PCB 153 zmenšilo množství jak celkového β-kateninu, tak jeho aktivní formy, která je defosforylovaná na Ser37 a Thr41 a která je hlavním koaktivátorem TCF/LEF-závislé transkripce v kanonické Wnt dráze. Proto jsme také zkoumali vliv PCB 153 na expresi jednoho z cílových genů Wnt dráhy, Axin2. PCB 153 snižoval bazální množství Axin2 mRNA a také inhiboval expresi Axin2 indukovanou rekombinantním myším Wnt3a. Funkce glykogensynthasakinasy 3β (GSK-3β) je označit β-katenin pro proteosomální degradaci. PCB 153 nemělo vliv na fosforylaci GSK-3β a tím pádem nesnižovalo její aktivitu, takže můžeme předpokládat, že GSK-3β se neúčastní zmenšení množství celkového a aktivního β-kateninu po PCB 153. Na druhou stranu lysosomální inhibitor leupeptin částečně obnovil proteinovou hladinu jak E-kadherinu, tak β-kateninu po PCB 153, z čehož vyplývá, že lysosomální degradace může být zapojena v odbourávání proteinů adherentních spojů po působení PCB 153. Koncept toxických ekvivalentů používaný pro hodnocení rizika PCB je založen na toxicitě zprostředkované aryl uhlovodíkovým receptorem (AhR). Tento koncept je ale vhodný pouze pro dioxinové PCB. Většina PCB v životním prostředí patří do skupiny NDL-PCB, které jsou nekoplanární a nejsou schopny aktivovat AhR. Pro ně neexistuje obecné hodnocení rizika částečně také z toho důvodu, že jejich toxicita není dostatečně charakterizována. Proto jsme přispěli do komplexní in vitro studie toxicity 24 PCB změřením jejich schopnosti inhibovat GJIC. Všechny testované nedioxinové kongenery akutně inhibovaly GJIC, což může být použito jako biomarker tumorové promoce. Díky malým rozdílům v relativních účinnostech mezi jednotlivými kongenery, k celkovému vypočítanému účinku na GJIC směsi PCB detekované v lidských vzorcích nejvíce přispívaly PCB, které se nejčastěji vyskytují v životním prostředí (tj. PCB 118, 138, 153, 168 a 180). V poslední části této studie jsme zkoumali regulaci Cx43 a GJIC po expozici WB-F344 buněk modelovým aktivátorem AhR, 2,3,7,8-tetrachlórdibenzo-p-dioxin (TCDD). Po dlouhodobém působení TCDD jsme pozorovali AhR-dependentní s

Abstract:

nížení množství proteinu Cx43 a částečnou inhibici GJIC. Toto může naznačovat další mechanismus toxického působení TCDD přispívající k jeho tumor promočním vlastnostem.

Abstract:

Non-dioxin-like polychlorinated biphenyls (NDL-PCBs) are persistent environmental toxicants that are bio-accumulated through the food chain. One of their toxic effects is the acute inhibition of gap junctional intercellular communication (GJIC), an event possibly associated with tumour promotion. 2,2',4,4',5,5'-Hexachlorobiphenyl (PCB 153), a model NDL-PCB, caused a sustained GJIC inhibition in rat liver epithelial WB-F344 cells. As this effect might be related to deregulation of connexin 43 (Cx43) synthesis, trafficking, or degradation, we investigated the impact of PCB 153 on these events. Although PCB 153 had no effect on Cx43 mRNA levels, it induced a gradual loss of Cx43 protein and significantly decreased the amount of gap junction (GJ) plaques in plasma membrane. PCB 153 contributed to extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 (ERK1/2)-dependent accumulation of hyperphosphorylated Cx43 form, thus indicating that ERK1/2 activation by PCB 153 might be involved in its effects on Cx43 internalization or degradation. Inhibition of either proteasomes or lysosomes with their specific inhibitors largely restored total Cx43 protein levels, thus suggesting that both proteasomes and lysosomes may participate in the PCB 153-enhanced Cx43 internalization and degradation. However, neither the proteasomal nor lysosomal inhibitors restored normal GJIC or number/size of GJ plaques. Finally, PCB 153 also interfered with restoration of GJ plaques following the inhibition of Cx43 transport to plasma membrane. Furthermore we analyzed the effect of PCB 153 on adherens junctions (AJ) proteins. PCB 153 induced a gradual degradation of E-cadherin, β-catenin or plakoglobin (γ-catenin) proteins. These effects were not due to changes in gene expression, as PCB 153 had no effect on mRNA levels of the AJ proteins. Moreover, apart from the reduction of total β-catenin pool, PCB 153 also decreased levels of the active β-catenin form, dephosphorylated at residues Ser37 and Thr41, which is the key co-activator of Wnt-induced TCF/LEF-dependent gene expression. Therefore, we also evaluated the impact of PCB 153 on expression of Axin2, a known transcriptional target of canonical Wnt signalling. PCB 153 reduced basal Axin2 mRNA levels and it inhibited induction of Axin2 expression by recombinant mouse Wnt3a. Nevertheless, PCB 153 had no effect on phosphorylation of glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β), which is supposed to target β-catenin for its proteasomal degradation. This suggested that GSK-3β activity is not modulated by PCB 153 and, consequently, not involved in the observed PCB 153-induced decrease of both total and active β-catenin levels. Protein levels of E-cadherin and β-catenin were partially restored with lysosomal inhibitor leupeptin, thus suggesting a possible role of lysosomes in the degradation of adherens junction proteins. The toxic equivalency concept used for the risk assessment of PCBs is based on the aryl hydrocarbon receptor (AhR)-mediated toxicity of coplanar dioxin-like (DL) PCBs. However, most PCBs in the environment are NDL-PCBs that cannot adopt a coplanar structure required for AhR activation. For NDL-PCBs, no generally accepted risk concept is available because their toxicity is insufficiently characterized. Therefore, we contributed to a complex in vitro study of toxicity of 24 PCBs by measuring their ability to inhibit GJIC. All tested NDL-congeners acutely inhibit GJIC, which may be used as a biomarker of tumour promotion. Due to small differences in relative potencies among the congeners, the highly abundant PCBs 118, 138, 153, 168, and 180 also contributed most to the tumour-promoting GJIC-inhibiting potencies calculated for PCB mixtures reported in human samples. In the last part of this study, we investigated the regulation of Cx43 and GJIC by prototypical AhR-activator 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxin (TCDD) in WB-F344 cells. TCDD reduced Cx43 protein level and suppressed GJIC in an AhR-dependent man

Abstract:

ner after a prolonged exposure, suggesting a novel mode of toxic action related to TCDD tumour promoting properties.

Keywords

PCB 153, NDL-PCB, TCDD, nádorová promoce, mezibuněčná komunikace, GJIC, konexin 43, β-katenin, E-kadherin, REP

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 30. 8. 2016

Thesis defence

• Date of defence: 23. 9. 2016
• Supervisor: RNDr. Miroslav Machala, CSc.
• Reader: prof. RNDr. Zdeněk Dvořák, DrSc. et Ph.D., prof. RNDr. Lenka Skálová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry (4-years) / Biochemistry