Renální in vitro modely v toxikologii

Bc. Renata Škovroňová

Master's thesis

Renal in vitro models in toxicology

Abstract:

Lidské ledviny jsou orgánem zodpovědným primárně za vstřebávání a vylučování látek, vznikajících přirozeně těle (endogenně) nebo i látek pocházejících z vnějšího prostředí (xenobiotika). Cílem této diplomové práce bylo popsat odlišné typy renálních buněk a popsat jejich in vitro modely pro toxikologické a farmaceutické testování látek. Zaměřila jsem se na (i) lidské telomerázou-imortalizované epiteliální buňky proximálního tubulu RPTEC/TERT1, a dále na (ii) podmíněně imortalizovatelné epiteliální buňky proximálního tubulu ciPTEC na pokročilém 3D modelu – tzv. Organ-on-a-chip. Cyanotoxiny jsou sekundární metabolity produkované sinicemi a představují důležitou skupinu nefrotoxinů přítomných v životním prostředí. Přítomnost cyanotoxinů je konečným důsledkem hromadění sinic ve vodních nádržích. Masivní produkce a uvolňování těchto toxinů na vodních hladinách pak znamená riziko pro zdraví lidí a zvířat.Hlavní část práce byla zaměřen na prostudování účinků cyanotoxinů microcystinu-LR (MC-LR) a cylindrospermopsinu (CYN) na buňky RPTEC/TERT1. Účinky cyanotoxinů (0.05- 10 μM, 96 h) na životaschopnost a další parametry byla zkoumána ve dvou modelech (i) ve standardním modelu buněk kultivovaných v jednoduché vrstvě v plastových mikrotitračních destičkách anebo (ii) na filtračních inzertech ve 2-komorovém modelu. Druhý zmíněný model s inzerty umožnil stanovení vlivu různých způsobů aplikace látek (apikálně, bazolaterálně a oboustranně). Výsledky ukázaly, že oba cyanotoxiny snižovaly konverzi resazurinu a produkci ATP u buněk kultivovaných v jedné vrstvě na plastových destičkách s EC50 ~4-6 μM, a zvyšovaly koncentraci laktátu v kultivačním médiu, což naznačuje buněčný stres. Účinky byly méně výrazné u kultur na filtračních inzertech, kdy bazolaterální aplikace toxinu vyvolávala silnější účinky MC-LR, zatímco CYN byl více toxický v případě apikální aplikace. Oba cyanotoxiny indukovaly při aplikaci z bazolaterální strany jen mírnou změnu transepiteliální elektrické rezistence (TEER). Specifické efekty závisející na typu a na aplikaci toxinu mohou být způsobeny rozdíly v expresi a lokalizaci membránových transportérových proteinů u různých renálních in vitro buněčných linií. V modelu buněk ciPTEC bylo zdokumentováno, že 3D kultivace v systému Organ-on-a-chip s mikroprouděním zvyšuje expresi membránových transportních proteinů MATE1 a MATE2k.

Abstract:

The human kidney is an organ primarily involved in the regulation of excretion and reabsorption of many diverse compounds, endogenous metabolites as well as xenobiotics. Many xenobiotics are also nephrotoxic compounds that can alter or damage the functionality of the kidney. In my thesis, in vitro cultures of different renal cell types and specifics of the renal in vitro models for toxicological and pharmacological testing were introduced. I focused on (i) the human telomerase-immortalized human epithelial cells from the proximal renal tubule (RPTEC/TERT1), and also (ii) conditionally immortalized proximal tubule epithelial cells (ciPTEC) in a more advanced 3D model, Organ-on-a-chip. Cyanotoxins, secondary metabolites of cyanobacteria, represent an important group of enviromnentally prevalent nephrotoxicants. Cyanotoxin occurrence is ubiquitary connected with the mass development of cyanobacteria in water reservoirs. Massive production and release of these toxins into the surface waters pose a risk to animal and human health. Therefore, the main part of my practical work was to study the effects of two common cyanobacterial toxins (microcystin-LR, MC-LR and cylindrospermopsin, CYN) on RPTEC/TERT1. The effects of cyanotoxins (0.05- 10 μM, 96 h) on the viability and proliferation of RPTEC/TERT1 cells were studied using a combination of methods and two types of models: cells grown traditionally in a monolayer culture attached to the plastic plates, or on the filter inserts in 2-compartmental model. By using the inserts, different types of compound application (apical, basolateral and both side) were evaluated. According to the results, both toxins decreased conversion of Resazurin and production of ATP in monolayer cultures on plastic with EC50 ~4-6 μM, and also increased concentration of lactate in culture medium, indicating cellular stress. The effects were less pronounced in the filter insert cultures, with basolateral application inducing stronger effects for MC-LR, while CYN was more toxic when applied appically. Either cyanotoxin induced slight alterations of transepithelial electrical ressistance (TEER) when applied basolaterally. Cyanotoxin-specific and application-specific effects could be caused by differences in the expression and localization of membrane transporters in different types of renal in vitro cells. In ciPTEC model, it has been documented that 3D Organ-on-a-chip culture with a fluid shear stress induces expression of drug transporter proteins MATE1 and MATE2k.

Keywords

ledviny, in vitro, 3D, renální modely, toxikologie, sinice, cyanotoxiny, microcystin-LR, cylindrospermopsin, kidney, renal models, toxicology, cyanobacteria, cyanotoxins

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 17. 5. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 7. 6. 2018
• Supervisor: RNDr. Pavel Babica, Ph.D.
• Reader: Mgr. Eliška Sychrová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Experimental Biology / Special Biology