Úloha arginasy v signálních drahách oxidu dusnatého a polyaminů v stresových odpovědích rostlin

Bc. Jakub FOLDYNA

Master's thesis

Role of arginase in signalling pathways of nitric oxide and polyamines in plant stress responses

Abstract:

Arginasa je manganoenzym, který katalyzuje hydrolytický rozklad L-argininu na ornithin a močovinu. U rostlin bylo zjištěno, že hraje důležitou dvojí roli ve vývoji rostlin. První role je v průběhu klíčení rostlin, kdy se aktivita arginasy zvyšuje. Další důležitou roli hraje arginasa při dozrávání plodů. Během působení stresových faktorů dochází k indukci exprese arginasy a předpokládá se, že arginasa je zapojena do odpovědi rostlin na stres. Tato diplomová práce byla v teoretické části zaměřena na dostupné poznatky o rostlinných arginasách včetně metod stanovení aktivity. Dále byly stručně charakterizovány dostupné poznatky o lokalizaci a produkci oxidu dusnatého u rostlin a znalosti o funkcích a metabolismu polyaminů u rostlin. V experimentální části byla jako modelová rostlina použita semena hrachu setého (Pisum sativum cv. Abarth), ze které byla izolována mitochondriální frakce. Byl sledován vývoj aktivity arginasy v průběhu klíčení a při pěstování za různých světelných podmínek (střídání světla a tmy a tma). Dále byl sledován vliv zamražení mitochondriální frakce a následného rozmražení na aktivitu arginasy. Rovněž se sledovala teplotní stabilita při různých teplotách a dobách aktivace. Byla stanovena hodnota Michaelisovy konstanty (66 mmol?l-1). V dalších experimentech byl zhodnocen vliv modifikačních činidel, ze kterých vyplývá, že se v blízkosti aktivního místa nachází cystein. V přítomnosti inhibitoru arginasy norvalinu v Hoagladově roztoku nebyly histochemicky zaznamenány změny v produkci oxidu dusnatého. Srovnáním sekvencí rostlinných arginas s genomem hrachu a provedenou nativní elektroforézou s následným barvením se lze domnívat, že u hrachu setého se nachází jediný protein s arginasovou aktivitou.

Abstract:

Arginase is a manganese-containing enzyme, which catalyzes the hydrolysis of L-arginine to ornithine and urea. In plants, arginase plays two important roles in development. The first role is during germination where the activity of arginase is increasing. Another important role of arginase was described during fruit development. During stress conditions, arginase expression is induced and it is assumed that arginase is involved in plant stress responses. This diploma thesis was in theoretical part focused on available knowledge of plant arginases including methods of activity measurement. Knowledge of localization and production of nitric oxide in plants and knowledge of functions and metabolism of plant polyamines was also characterized. In experimental part were used pea (Pisum sativum cv. Abarth) seeds were used as a model organism to isolate mitochondrial fraction. Changes in the specific activity of arginase were observed during germination and growth under different light conditions (alternation of light and dark and dark). Impact of freezing and thawing of mitochondrial fraction was examined and also the impact of different temperatures and time of activation. Value of Michaelis constant was determined (66 mmol?l-1). In the next experiments the impact of modifying reagents on activity of the arginase was evaluated. From results it can be concluded that a cystein residue is located near the enzyme active site. Histochemical production of nitric oxide in lateral roots was not affected by the presence of arginase inhibitor norvaline. From comparing plant sequences with the pea genome and native electrophoresis with subsequent staining we can assume that pea contains one protein with arginase activity.

Keywords

Arginasa, oxid dusnatý, polyaminy, Pisum sativum cv. Abarth

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 11. 5. 2020

Thesis defence

• Date of defence: 16. 6. 2020
• Supervisor: prof. Mgr. Marek Petřivalský, Dr.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry