Studium vzniku rezistence během protinádorové léčby

Ing. Soňa Křížková, Ph.D.

Disertační práce

Study of the resistance formation during the antitumor therapy

Anotace:

V práci byla studována souvislost obsahu metalothioneinu (MT) a rezistencí či senzitivitou nádorových buněčných linií k platinovým cytostatikům a těžkým kovům. V případě stanovení MT ve čtyřech lidských primárních buněčných liniích melanomu bylo zjištěno, že obsah MT je více než trojnásobný ve srovnání s kontrolní linií (kožní buňky bez známek nádorové transformace). Stanovený obsah MT v 10 000 buněk byl v jednotlivých liniích 21 pmol, 56 pmol, 54.5 pmol, 32 pmol a u kontrolní linie byl obsah MT 7.5 pmol na 10 000 buněk. Dále bylo zjištěno, že rezistentní a senzitivní buněčné linie neuroblastomu se liší v rychlosti a intenzitě indukce MT v závislosti na koncentraci cisplatiny a karboplatiny. Obsah MT u rezistentních linií byl až o 60 % zvýšený ve srovnání s mateřskou linií. MT pravděpodobně přispívá ke zvýšenému přežívání buněk v přítomnosti cytostatik zároveň s jejich sníženou viabilitou a tedy celkově méně intenzivním metabolismem. Kadmium je známý karcinogen a zároveň je osvědčeným induktorem MT. Buněčné linie lidských fibroblastů odvozené z primárního karcinomu kůže byly vystaveny 0, 1, 5 a 10 µM CdNO3. Byla stanovena celková viabilita, obsah MT a glutathionu. Bylo zjištěno, že zatímco na počátku experimentu buňky vykazovaly přibližně o 60 % nižší viabilitu ve srovnání s kontrolou, v průběhu expozice se jejich viabilita zvýšila a zároveň buňky reagovaly zvýšenou syntézou MT a glutathionu. Zároveň byla studována hladina MT séru pacientů s nádorovými onemocněními. Bylo zjištěno, že hladina MT v krevním séru je v průměru 5 × zvýšená ve srovnání s kontrolní skupinou. Uvedené výsledky ukazují na možnou roli MT v nádorovém onemocnění. Stanovení hladiny MT v krevním séru lidských pacientů ukazuje na diagnostický potenciál elektrochemické detekce MT. Z tohoto důvodu byl zkoumán příspěvek MT k celkovému elektrochemickému signálu. V případě srovnání hodnot naměřených pomocí Brdičkovy reakce a ELISA jsme získali korelační koeficient vyšší než 0.99 v případě standardu, pro vzorky lidského krevního séra byl korelační koeficient mezi stanovenými hodnotami vyšší než 0.935. Vztah mezi naměřenými hodnotami bylo možno vyjádřit rovnicí: MT(ELISA) = 0.504 × MT(Brdičkova reakce) + 1.211. Na základě získaných výsledků je možno tvrdit, že MT je vhodnou biomolekulou pro diagnostiku nádorového onemocnění a pro predikci vzniku rezistence k cytostatikům.

Abstract:

In this thesis a connection between metallothionein (MT) content and resistance or sensitivity of tumour cell lines to platinum-based cytostatics and heavy metals was studied. In four human melanoma primary cell lines MT content was more than threefold higher compared to control (skin cells without malignant transformation). The determined MT content per 10 000 cells was 21 pmol, 56 pmol, 54.5 pmol, 32 pmol, in control line MT content was 7.5 pmol per 10 000 cells. Moreover resistant and sensitive human neuroblastoma cell lines differ in rapidity and intensity of MT induction in dependence on cisplatin and carboplatin concentration; the observed MT content in resistant lines was up to 60 % increased compared to control mother line. Therefore MT probably contributes to better survival of tumour cells in presence of cytostatic together with their decreased viability and generally less intensive metabolism. Cadmium is a known carcinogen and it is a good inductor of MT. Human fibroblast cell lines derived from primary skin carcinoma were exposed to 0, 1, 5, and 10 µM CdNO3. In the cells viability, MT and glutathione content were determined. In comparison at the beginning of the experiment tumour cells exhibited 60 % viability compared to controls, but during the exposition their viability increased and MT and glutathione synthesis increased simultaneously. At the same time MT level was determined in serum of human patients with a tumour disease. Compared to healthy controls, MT level was in average 5 × increased. The results obtained indicate, that MT has a possible role in tumour disease. Electrochemical determination of MT in serum is a potential diagnostic tool, on this account the contribution of MT to total signal was investigated. When we compared the values obtained either by Brdicka reaction and ELISA, the correlation coefficient for a commercial standard was higher than 0.99, for human blood serum samples the correlation coefficient was higher than 0.935. Relation between determined values was possible to express by equation: MT(ELISA) = 0.504 × MT(Brdicka reaction) + 1.211. In conclusion, electrochemical determination of MT gives reliable results and it can be used for a routine analysis and MT is a potentially suitable biomolecule for tumour diagnosis and prediction of the tumour response to cytostatics.

Klíčová slova

Metalothionein, Chemorezistence, Cisplatina, Buněčné linie, Elektrochemická detekce, Protilátky Metallothionein, Chemoresistance, Cisplatin, Cell lines, Electrochemical detection, Antibodies

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 17. 5. 2010

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 17. 9. 2010
• Vedoucí: doc. Ing. René Kizek, Ph.D.
• Oponent: doc. RNDr. Miroslav Fojta, CSc., RNDr. Lenka Dubská, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biologie (čtyřleté) / Molekulární a buněčná biologie