Kontrolní mechanismy sestavení dělícího vřeténka u savčích oocytů

Bc. Lenka Libichová

Master's thesis

The control mechanisms of spindle assembly in mammalian oocytes

Abstract:

Kontrolní mechanismy sestavení dělícího vřeténka se účastní regulace buněčného dělení. Tyto mechanismy monitorují správnost připojení mikrotubul na kinetochory, a předchází tak poruchám segregace chromozomů, které jsou obzvlášť u savčích oocytů velmi časté. Mezi tyto kontrolní mechanismy patří především kontrolní bod sestavení dělícího vřeténka (SAC, z angl. Spindle Assembly Checkpoint), který zastavuje buněčné dělení, dokud nejsou všechny chromozomy připojeny na dělící vřeténko správně. Mechanismus korekce chyb se zase podílí na destabilizaci chybných interakcí. Cílem této diplomové práce je zmapovat výskyt a lokalizaci důležitých molekul, které řídí sestavení dělícího vřeténka během meiózy. Pro splnění tohoto cíle je provedena lokalizace proteinů BubR1 a aurora A za fyziologických podmínek a také za použití různých inhibitorů buněčného cyklu. Dále je připravena cDNA proteinu aurora A pomocí klonování, vyrobena mRNA a mikroinjikována do oocytů za účelem overexprese a následné lokalizace tohoto proteinu. V teoretické části jsou shrnuty základní poznatky týkající se savčích oocytů, meiózy a regulace tohoto buněčného dělení. Dále jsou diskutovány kontrolní mechanismy sestavení dělícího vřeténka i chyby segregace chromozomů, ke kterým během meiózy dochází. Veškeré experimenty v experimentální části jsou prováděny na myších oocytech, které byly získány technikami izolace oocytů a mikromanipulace. Metoda nepřímé imunofluorescence je použita pro lokalizaci daných proteinů. Obrazová data získaná za použití různých metod mikroskopie jsou analyzována v programu ImageJ. Výsledky získané v této práci přispívají k objasnění regulace meiózy a kontrolních mechanismů sestavení dělícího vřeténka.

Abstract:

The control mechanisms of spindle assembly are involved in the regulation of cell division. They monitor the correct attachment of microtubules to kinetochores, thus preventing chromosome segregation disorders, which are particularly common in mammalian oocytes. These control mechanisms include mainly Spindle Assembly Checkpoint (SAC) which stops cell division until all chromosomes are correctly attached to the spindle. Whereas the Error Correction Mechanism is involved in destabilizing erroneous interactions. The aim of this thesis is to map presence and localization of important molecules which control spindle assembly during meiosis. To accomplish this aim, localization of BubR1 and aurora A proteins under physiological conditions and in various inhibitors of cell cycle as well is performed. Furthermore, the cDNA of aurora A protein is prepared by cloning, mRNA made and microinjected into oocytes to overexpress and subsequently localize this protein. The theoretical part summarizes basic knowledge about mammalian oocytes, meiosis and regulation of this cell division. Moreover, the control mechanisms of spindle assembly and chromosome segregation errors occurring during meiosis are discussed. All experiments in experimental part are performed on mouse oocytes which have been obtained by isolation and micromanipulation techniques. The indirect immunofluorescence method is used for protein localization. Data obtained by various microscopy methods were analyzed using the ImageJ program. The results obtained in this work contribute to elucidation of regulation of meiosis and spindle assembly control mechanisms.

Keywords

Meióza, Myší oocyty, Kontrolní mechanismy, SAC, Dělící vřeténko, BubR1, Aurora A, Reversine, proTAME, MG132, Imunofluorescence, Meiosis, Mouse oocytes, Control mechanisms, Spindle, Immunofluorescence

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 10. 5. 2019

Thesis defence

• Date of defence: 5. 6. 2019
• Supervisor: MVDr. Martin Anger, CSc.
• Reader: RNDr. Petr Vaňhara, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Experimental Biology / Molecular Biology and Genetics