Genetická determinace embryogeneze uArabidopsis thaliana

Mgr. Zdeňka Kyjovská, Ph.D.

Disertační práce

Genetic determination of embryogenesis in Arabidopsis thaliana

Anotace:

Genetická determinace embryogeneze u Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Současné pokroky ve studiu genomu Arabidopsis thaliana společně se znalostí kompletní sekvence tohoto genomu umožňují na základě fenotypového projevu mutace identifikaci kandidátních genů na molekulární úrovni a také charakterizaci jejich funkcí. V předložené disertační práci bylo použito sedm různých mutantních linií (VIII-41, VIII-62, VIII-75, VIII-82, VIII-111, 280-4-4 a 280-4-8) s defekty ve vývoji semen, které byly identifikované v kolekci T-DNA mutantů (ekotyp Columbia). U všech linií byla genetickou analýzou potvrzena monogenní dědičnost znaku, recesivita mutantní alely a její letalita v homozygotním stavu. Embryogeneze byla zastavena v různých fázích, které jsou nezbytné pro životaschopnost embryí a jejich vývoj. Cílem práce bylo provést genetickou a morfologickou studii T-DNA mutací, které ovlivňují embryonální vývoj, lokalizovat mutantní alely do genetické mapy A. thaliana pomocí DNA markerů a charakterizovat (vyhledání) kandidátní geny pro studované mutace. Při přípravě F2 populací byly kříženy heterozygotní rostliny všech sedmi mutantních linií s rostlinami standardní linie A. thaliana ekotypu Landsberg erecta. Celkem 37 mikrosatelitových a 30 CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) markerů bylo použito při molekulární rekombinační analýze generace F2. U všech použitých DNA markerů byl testován polymorfismus mezi čtyřmi ekotypy A. thaliana, Columbia, Landsberg erecta, S96 a Dijon G. Pro molekulární mapování byla použita pouze genotypová/fenotypová kategorie dominantních homozygotů populace F2 z důvodu snížení počtu testovaných rostlin a zachování přesnosti mapování. Nejmladší defektní embrya, jejichž vývoj byl zastaven v globulární fázi, byla pozorována u mutantní linie VIII-64. Buňky vnější vrstvy protodermu byly charakterizované abnormálním dělením a vakuolizací. Mutace VIII-41 se projevovala defektem v pozdním globulárním stadiu a k ukončení embryonálního vývoje docházelo během přechodu z globulární do srdčité fáze. Mutace VIII-111 se projevovala v srdčité fázi a je spojena s vývojem základů děloh. Dochází k abnormálnímu buněčnému dělením prekurzorů stonkového apikálního meristému. Mutantní projev linie VIII-82 byl identifikován v srdčitém stadiu až ve stadiu torpédovitém. Mutace je charakteristická asymetrickým dělením v oblasti základů děloh. V pozdním embryonálním stadiu byly pozorovatelné chlorofylové defekty u dvou mutací VIII-75 a 280-4-8. Suspenzor tvořený dvěma řadami buněk a ukončení embryonálního vývoje v globulární fázi byla zjištěna u mutace 280-4-4. Do genetické mapy A. thaliana byly na krátké rameno chromozomu 1 lokalizovány dvě mutace, VIII-111 a 280-4-4. Pozice mutace VIII-41 byla stanovena na dlouhé rameno chromozomu 2. Dvě embryonálně letální mutace VIII-82 a 280-4-8 byly lokalizovány na dlouhé a krátké rameno chromozomu 3. Mutace VIII-64 byla lokalizována na dlouhé rameno chromozomu 4. Pouze mutace VIII-75 nebyla lokalizována na žádný z pěti chromozomů A. thaliana. V rámci přeložené práce byly hledány kandidátní geny pro jednotlivé mutace, které jsou lokalizované na chromozomu v intervalu určeném mapováním. Nově identifikované embryonálně letální mutace jsou počátečním krokem pro detailnější molekulární analýzu a izolaci mutantních genů. Také vysycení genetické mapy A. thaliana geny se známým fenotypovým projevem je nezbytné pro funkční analýzu tohoto genomu.

Abstract:

Genetic determination of embryogenesis in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Recent advances in Arabidopsis genomic studies together with comprehensive sequence information make it possible to characterize phenotypic mutants for related genes at the molecular level and reveal their functions. Seven different mutations (VIII-41, VIII-62, VIII-75, VIII-82, VIII-111, 280-4-4 and 280-4-8) with defects in immature seed development have been identified during screening of a T-DNA collection of Arabidopsis thaliana (ecotype Columbia) were used in the present study. The mutations were confirmed to be monogenic and recessive-lethal by genetic analysis. Mutant embryos were blocked in certain steps in the process necessary for embryo viability and development. The aim of our work was to make the genetic and morphological studies of T-DNA mutations affecting embryo development and localize the mutant alleles on the genetic map of A. thaliana by DNA markers and characterize the candidate genes. Crosses between heterozygote plants of each mutation and wild-type of A. thaliana (Landsberg erecta) were prepared. A total of 37 microsatellites and 30 cleaved amplified polymorphic sequences were employed to carry out the recombination analysis in F2 populations. The whole collection of DNA markers was used to study polymorphisms among four different ecotypes of A. thaliana; Columbia, Landsberg erecta, S96 and Dijon G. The wild-type phenotypic categories from individual F2 populations were used for genetic mapping for the purposes of reducing the number of tested plants and keeping a high level of resolution. The youngest embryos with a defect were observed at the globular stage in the VIII-64 mutation. Externally located cells, precursor of the protoderm, were characterized by abnormal cell division. The VIII-41 mutation with a defect at the late globular stage was arrested at the globular-heart stage transition. The VIII-111 mutation showed defect at heart stage of embryogenesis with atypical development of cotyledon primordia. The defect was associated with abnormal pattern of cell division constituting the precursor of the shoot apical meristem. In the VIII-82 mutation defect in torpedo stage with asymmetric cotyledons was observed. Cotyledon stage of embryos and chlorophyll defect were observed in VIII-75 and 280-4-8 mutations. Abnormal suspensor consisting of two columns of cells was observed in the 280-4-4 mutation. Two embryo-lethal mutations 280-4-4 and VIII-111 were localized on the short arm of chromosome 1. The position of VIII-41 mutation was assigned on the long arm of chromosome 2. Two embryo-lethal mutations VIII-82 and 280-4-8 were localized on the long and short arm of chromosome 3, respectively. The VIII-64 mutation was located on the long arm of chromosome 4. Only one mutation VIII-75 was not assigned on any of five chromosomes of A. thaliana. The candidate genes from identified chromosomal regions responsible for defective embryo development of our mutations are discussed. Newly identified embryo-lethals can serve as starting material for more detailed genetic and molecular studies and the isolation of gene of interest. In addition, saturation of the A. thaliana genetic map with genes of known phenotypic manifestation will help further detailed analysis of its genome.

Klíčová slova

Arabidopsis thaliana, embryonálně letální mutace, morfologie embryí, T-DNA, genetická analýza, DNA markery, molekulární mapování, EMB geny Arabidopsis thaliana, embryo-lethal mutants, embryo morphology, genetic analysis, DNA markers, molecular mapping, EMB genes

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 21. 11. 2006

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 20. 11. 2006
• Vedoucí: doc. RNDr. Jana Řepková, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biologie / Obecná a molekulární genetika