Lipidomická analýza rostlinných a živočišných tkání technikou HPLC/MS

Ing. Eva Cífková

Doctoral thesis

Lipidomic analysis of plant and animal tissues using HPLC/MS

Abstract:

Lipidy jsou důležitou složkou všech biologických tkání s řadou důležitých rolí souvisejících se správnou funkcí organismu. Základním požadavkem lipidomických studií je identifikace a kvantifikace velkého množství lipidů ve složitých biologických vzorcích. Spojení vysokoúčinné kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií má velký potenciál získat detailní informace o celém lipidomu, ale spolehlivá identifikace a kvantifikace všech tříd lipidů je stále náročný úkol kvůli velké komplexitě vzorků lipidů a jejich amfipatickému charakteru. V první dimenzi byl celkový extrakt lipidů separován pomocí kapalinové chromatografie hydrofilních interakcí (HILIC) na jednotlivé třídy lipidů. Podmínky HILIC separace byly optimalizovány za účelem dosáhnout co největšího počtu separovaných tříd lipidů. Byl testován vliv náplně kolony, složení mobilní fáze, teploty kolony a sklonu gradientu na účinnost separace. Bylo zjištěno, že množství vody v mobilní fázi má zásadní vliv na selektivitu a účinnost separace. Optimalizovaná HILIC metoda umožnila separaci 16 tříd lipidů a 3 regioisomerních párů v jedné analýze. Jednotlivé třídy lipidů byly identifikovány pomocí hmotnostní spektrometrie s ionizací elektrosprejem (ESI-MS). Pro získání detailních informací byly frakce separovaných tříd lipidů v první dimenzi preparativně izolovány a separovány v druhé dimenzi pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie v systémech s obrácenými fázemi (RP-HPLC) na jednotlivé lipidy. Stejně jako pro HILIC separaci, zvláštní pozornost byla věnována optimalizaci podmínek za účelem dosažení maximálního počtu separovaných lipidů. Jednotlivé polární lipidy byly identifikovány pomocí ESI-MS, zatímco nepolární lipidy pomocí chemické ionizace za atmosférického tlaku (APCI). Druhá část práce byla věnována necílené metodě kvantifikace celých tříd lipidů separovaných HILIC-HPLC/ESI-MS metodou při záznamu kladných iontů pomocí jednoho interního standardu a odezvových faktorů daných tříd lipidů. Odezvové faktory byly vypočteny z parametrů kalibračních závislostí interního standardu a standardů jednotlivých tříd lipidů. Koncentrace dané třídy lipidů byla vypočtena jako součin plochy píku v HILIC chromatogramu a odezvového faktoru dané třídy vztažené k internímu standardu. Přesnost a správnost našich výsledků byla potvrzena srovnáním s běžně používanou metodou kvantitativní analýzy s využitím skenu vybraných iontových reakcí (SRM) pomocí trojitého kvadrupólu a také kvantifikací pomocí nukleární magnetické resonance. Možnost použití různých typů biologických vzorků byla testována na lidské referentní plazmě a vaječném žloutku. V poslední části práce byla provedena detailní charakterizace jednotlivých tříd lipidů v orgánech prasete (mozek, srdce, ledvina, játra, plíce, mícha, slezina a žaludek) pomocí naší necílené kvantitativní analýzy. Jednotlivé lipidy uvnitř těchto tříd byly identifikovány pomocí relativních intenzit deprotonovaných molekul [M-H]- při záznamu záporných iontů ESI spekter a pomocí off-line dvoudimenzionální HILIC x RPHPLC/ ESI-MS. Průměrné hodnoty počtu atomů uhlíku a počtu dvojných vazeb analyzovaných orgánů prasete byly vypočteny na základě složení jednotlivých lipidů a byly použity pro jejich charakterizaci. Složení mastných kyselin v orgánech prasete bylo po transesterifikaci methanolátem sodným určeno pomocí plynové chromatografie s plamenově-ionizační detekcí.

Abstract:

Lipids are important components in all biological tissues having many essential roles associated with the proper function of the organism. The identification and quantitation of a wide range of lipids in complex biological samples is an essential requirement for the lipidomic studies. High-performance liquid chromatography ? mass spectrometry coupling has the highest potential to obtain detailed information on the whole lipidome, but the reliable identification and quantitation of multiple lipid classes is still a challenging task due to the extreme sample complexity of lipids and their amphipathic character. Lipid extracts were separated using hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) into individual lipid classes in the first dimension. The HILIC separation conditions were optimized to achieve the highest number of separated lipid classes. The influence of column packing, mobile phase composition, separation temperature and gradient steepness were tested to achieve the best chromatographic resolution. The crucial influence of water contents in the mobile phase on the separation selectivity and chromatographic resolution was observed. Optimized HILIC method enabled separate 16 lipid classes and 3 regioisomeric pairs in one analytical run. Individual lipid classes were identified using electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS). For the detailed information, the fractions of lipid classes separated in the first dimension were manually collected and further separated in the second dimension into individual lipid species using reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC). As for the HILIC method, the special attention was paid to the optimization of chromatographic conditions to achieve the highest number of separated species. ESI-MS was used for the identification of polar lipid species, while atmospheric pressure chemical ionization (APCI) was prefered for non-polar lipid species. The second part of this work was devoted to the nontargeted quantitation of lipid classes separated by HILIC-HPLC/ESI-MS method in the positive-ion mode using a single internal standard and lipid class response factors. Response factors were calculated from parameters of calibration curves measured for the internal standard and standards of individual lipid classes. The concentration of lipid class was obtained by the peak area in the HILIC chromatogram multiplied by RF related to the single internal standard. The accuracy and precision of our results were confirmed by the comparison with established selected reaction monitoring (SRM) quantitation approach on triple quadrupole mass spectrometer and also nuclear magnetic resonance quantitation. The applicability for various types of biological samples was tested on human reference plasma and egg yolk. In the last part of this work, the comprehensive lipidomic characterizations of porcine organs (brain, heart, kidney, liver, lung, spinal cord, spleen and stomach) were performed using our developed nontargeted quantitative method of lipid classes. Individual lipid species inside these classes were determined based on relative abundances of deprotonated molecules [M-H]- in the negative-ion ESI mode and off-line HILIC x RPHPLC/ ESI-MS. The average values of numbers of carbon atoms and double bonds of analyzed porcine organs were calculated based on the lipid species composition and used for their characterization. The fatty acid composition of porcine organs was determined by gas chromatography with the flame ionization detection after the transesterification with sodium methoxide.

Keywords

lipidomika, lipidy, fosfolipidy, kapalinová chromatografie hydrofilních interakcí, kapalinová chromatografie v obrácených fázích, dvoudimenzionální kapalinová chromatografie, hmotnostní spektrometrie, kvantitativní analýza, orgány prasete

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 31. 1. 2013

Accessible from:: 31. 12. 2999

Thesis defence

• Date of defence: 26. 2. 2013

University of Pardubice

Faculty of Chemical Technology

Doctoral programme / field:
Analytical Chemistry / Analytical Chemistry