Molekulární mechanizmus účinku sulfanu v průběhu meiotického zrání prasečích oocytů

Andrea Veselá

Master's thesis

Molecular mechanism of hydrogen sulfide action during meiotic maturation of porcine oocytes

Abstract:

V současné době jsou reprodukční biotechnologické metody na vzestupu, ale jejich rozvoj a uplatnění v širším managementu reprodukce závisí na získání dostatečného počtu kvalitních oocytů kultivovaných v in vitro podmínkách. Předpokladem tohoto požadavku je vytvoření optimálních podmínek v průběhu kultivace oocytů. Pochopení a znalost procesů, ke kterým v oocytu během zrání dochází, je důležitou a nezbytnou podmínkou optimalizace procesu kultivace oocytů v in vitro podmínkách a zisku dostatečného množství kvalitních oocytů v metafázi II. meiotického dělení. Je známo velké množství mechanismů, které zrání oocytů ovlivňují a řídí, nicméně i přesto nelze tvrdit, že by tento proces byl plně objasněn a prostudován. Jedním z faktorů, který má možnou úlohu v regulaci meiotického zrání oocytů je gasotransmiter sulfan (H2S), důležitá signální molekula endogenního původu. Na základě studia H2S byla stanovena hypotéza, že H2S aktivně ovlivňuje průběh meiotického zrání prasečích oocytů prostřednictvím regulace klíčových signálních kaskád. Cílem práce bylo stanovit zapojení H2S do regulace signální kaskády MEK1-MAPK, odpovědné za iniciaci a průběh meiotického zrání oocytů, a kaskády MEK1-PARP-1, jako signalizaci podporující životaschopnost buněk. Pro tento účel byly použity prasečí oocyty, které byly kultivovány v modifikovaných médiích s přídavkem specifické kombinace inhibitorů enzymů (3Ki) nebo v kultivačním médiu s donorem H2S. Oocyty byly následně podrobeny imunocytochemickému barvení, fluorescenční mikroskopii a analýze obrazu. Z výsledků je patrné, že H2S se podílí na regulaci meiotického zrání. Byla potvrzena hypotéza o vlivu endogenní produkce H2S na průběh meiotického zrání prasečích oocytů a ovlivnění signální kaskády MAPK. Na základě dosažených výsledků je však pravděpodobné, že signální kaskáda MEK1-PARP-1 není H2S ovlivněna, na rozdíl od MAPK signalizace, zahrnující zmíněnou MEK1 jako nadřazenou kinázu. MAPK kinázová aktivita je v oocytech signifikantně nižší po ošetření 3Ki. Další experimenty jsou pro detailnější pochopení těchto regulačních drah a k vhodnému ověření mechanizmu účinku H2S nezbytné, zejména pak pro úplné objasnění regulace cílových faktorů prostřednictvím post-translační modifikace S-sulfhydratací.

Abstract:

At present reproductive biotechnology methods are on the rise, but their development and application in the broader management of reproduction is dependent on obtaining a sufficient number of quality oocytes cultured in vitro. The prerequisite for this requirement is the creation of the optimal conditions in the course of culturing oocytes. Understanding and knowledge of the processes that occur in oocyte during maturation is an important and necessary condition for optimizing the process of culturing oocytes in vitro and gaining a sufficient number of good quality oocytes in metaphase II of meiotic division. A large number of mechanisms that affect and control oocyte maturation are known, however it cannot be claimed that this process has been fully explained and studied. One factor which has a potential role in the regulation of meiotic maturation of oocytes is gasotransmitter hydrogen sulfide (H2S), a critical signaling molecule of endogenous origin. The study of H2S led to the hypothesis that H2S actively influences the course of meiotic maturation of pig oocytes by regulating key signaling cascades. The aim of this work was to determine the involvement of H2S in the regulation of the MEK1-MAPK signaling cascade, responsible for the initiation and progress of the meiotic maturation of oocytes and the MEK1-PARP-1 cascade as signaling that supports cell viability. For this purpose, pig oocytes cultured in modified media were used, supplemented with a specific combination of enzyme inhibitors (3Ki) or in a culture medium with donor H2S. The ocytes were then subjected to immunocytochemistry staining, fluorescence microscopy and image analysis. The results show that H2S is involved in the regulation of meiotic maturation. It confirmed the hypothesis of the endogenous production of H2S in the course of the meiotic maturation of pig oocytes and the influence of the MAPK signaling cascade. Based on the results, it is however likely that the MEK1-PARP-1 signaling cascade is not affected by H2S, unlike MAPK signaling, comprising the mentioned MEK1 as superior kinase. MAPK kinase activity is significantly lower in oocytes after treatment 3Ki. Further experiments are for a detailed understanding of these regulatory pathways and for the proper verification of the mechanism of the effects of H2S necessary, in particular for a full understanding of the target control factors by the post-translational modification of S-sulfhydration.

Keywords

oocyt, meiotické zrání, sulfan, MEK1, PARP1, MAPK

Keywords

oocyte, meiotic maturation, hydrogen sulfide, MEK1, PARP1, MAPK

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 4. 4. 2016

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Kristýna Hošková, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Genetic Technologies and Breeding / Biotechnology of Reproduction