Hodnocení morfologicko - dynamických vlastností živých nádorových buněk digitální holografickou mikroskopií

MUDr. Miroslav Veselý, Ph.D.

Doctoral thesis

Evaluation of morphological and dynamical features of live cancer cell with holographic microscopy

Abstract:

Úvod: Pokročilá inoperabilní stádia dlaždicobuněčného karcinomu hlavy a krku (HNSCC) představují velký klinický problém s omezenými možnostmi léčby. S cílem predikce biologického chování a individualizace léčby je zkoumáno množství molekulárně–genetických biomarkerů, které ale doposud nejsou v klinické praxi využívány. Cíle: Hlavním cílem práce bylo prezentovat metodiku využívající koherencí řízenou holografickou mikroskopii (CCHM) k hodnocení morfologicko-dynamických vlastností buněk primokultur HNSCC získaných kultivací bioptických vzorků, ověřit možnosti využití primárních buněčných kultur z biopsie HNSCC pro účely CCHM a definovat nové potenciální biomarkery HNSCC vycházející z hodnocení dynamického fenotypu buněk HNSCC pomocí CCHM. Metodika: Byla použita metoda tkáňových fragmentů k získání primárních buněčných kultur z biopsie HNSCC. Pomocí CCHM byla provedena kvantitativní analýza dynamického fenotypu buněk z primární kultury HNSCC a byla hodnocena mitotická a migrační aktivita. Standardizovaná buněčná linie dlaždicobuněčného karcinomu FaDu byla použita jako referenční buněčná linie. Získaná data byla zpracována statisticky. Výsledky: U 4 z 8 bioptických vzorků TU01 – TU08 byly získány viabilní buňky, přičemž ve třech případech došlo k nežádoucímu přerůstání fibroblastů. U buněk primární kultury TU06 byl prokázán karcinomový původ pomocí western blotu a imunoflurescence. Tyto buňky exprimovaly epiteliální marker E-kadherin a p63, zatím co přítomnost vimentinu jako mesenchymálního markeru prokázána nebyla. Průměrná délka buněčného cyklu (doubling time) u TU06 byla 15,10 h u buněk FaDu 20,04 h. Průměrná rychlost buněk TU06 byla 81,63877 µm/h, ve srovnání s buňkami linie FaDu se buňky TU06 pohybovaly 8x rychleji. Buňky TU06 aktivně migrovaly a dosahovaly délky trajektorie až 300 μm, zatímco migrační aktivita FaDu byla téměř nulová. Rozdíly v mitotické i migrační aktivitě mezi TU06 a FaDU byly statisticky významné. Dále byly definovány základní morfologicko-dynamické znaky buněk primokultur HNSCC pomocí CCHM. Závěr: Prezentovaný postup získávání primárních kultur HNSCC musí být zdokonalen a ověřen na větším počtu vzorků. Domníváme se, že objektivně měřitelné parametry jako je doubling time, rychlost pohybu buněk a délka trajektorie migrujících buněk vypovídají o maligním potenciálu buňky a lze je považovat za potenciální biomarkery HNSCC. Předpokládáme, že tyto vlastnosti se v přítomnosti cytostatik budou měnit. Takový přístup by mohl být využit v testech chemosenzitivity a chemorezistence.

Abstract:

Introduction: Advanced inoperable stages of squamous cell carcinoma of the head and neck (HNSCC) represent a serious clinical problem with limited treatment options. A number of molecular - genetic biomarkers are investigated in order to predict biological behavior and individualization of treatment. These biomarkers are not routinely used in clinical practice. Aims: The main aim of the work was to present a method of coherence controlled holographic microscopy (CCHM) to evaluate the morphological-dynamic characteristics of HNSCC primary culture cells obtained by culturing biopsy samples, to verify the use of primary cell cultures from HNSCC biopsy for CCHM and to define new potential HNSCC biomarkers based on evaluation of the dynamic phenotype of HNSCC cells using CCHM. Methodology: The tissue fragment method was used to obtain primary cell cultures from HNSCC biopsy. Quantitative analysis of the dynamic phenotype of cells from the primary culture of HNSCC was performed using CCHM and mitotic and migration activity was measured. The standardized squamous cell carcinoma cell line FaDu was used as the reference cell line. The obtained data were processed statistically. Results: Viable cells were obtained in 4 of 8 biopsy samples TU01 - TU08, with undesired fibroblast overgrowth occurring in three cases. Carcinoma origin of TU06 primary culture cells was evaluated by western blot and immunofluorescence. These cells expressed the epithelial markers E-cadherin and p63, while the presence of vimentin as a mesenchymal marker was not confirmed. The average cell cycle duration (doubling time) was 15.10 h for TU06 cells and 20.04 h for FaDu cells. The average speed of TU06 cells was 81.63877 µm / h, compared to TU06 cells, TU06 cells moved 8x faster. TU06 cells actively migrated and reached trajectory lengths of up to 300 μm, while FaDu migration activity was almost zero. The differences in mitotic and migratory activity between TU06 and FaDU were statistically significant. Furthermore, the basic morphological - dynamic features of HNSCC primary culture cells were defined using CCHM. Conclusion: The presented procedure for obtaining primary cultures of HNSCC must be improved and verified on a larger number of samples. We believe that objectively measurable parameters such as doubling time, cell speed and trajectory length of migrating cells indicate the malignant potential of the cell and can be considered as potential biomarkers of HNSCC. We assume that these properties and in the presence of cytostatics will change. Such an approach could be used in chemosensitivity and chemoresistance assays.

Keywords

Karcinom hlavy a krku, primární kultury, koherencí řízený holografický mikroskop, fázové zobrazení, zobrazení živých buněk, biomarkery

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 20. 8. 2021

Thesis defence

• Date of defence: 31. 1. 2022
• Supervisor: doc. MUDr. Břetislav Gál, Ph.D.
• Reader: prof. MUDr. Rom Kostřica, CSc., Ing. Zbyněk Dostál, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Dentistry and otorinolaryngology / Otorinolaryngology