Studium procesů probíhajících v živých buňkách pomocí mikroskopických fluorescenčních in vivo metod

Bc. Michal Zimmermann, Ph.D.

Diplomová práce

Anotace:

Náplní této práce bylo studium buněčné lokalizace a vzájemné kolokalizace proteinů AIF, endonukleázy G a AMID, u kterých se předpokládá funkce při apoptóze nezávislé na kaspázách, a zároveň studium jejich předpokládané translokace do jádra v průběhu apoptózy vyvolané proteinkinázovým inhibitorem staurosporinem. K tomuto účelu byly použity moderní metodické přístupy, jako jsou bioinformatická predikce lokalizace proteinu na základě primární struktury, vizualizace buněčných proteinů navázanými fluorescenčními proteiny, fluorescenční mikroskopie živých buněk a softwarová analýza obrazu. Byly navrženy savčí expresní vektory nesoucí geny kódující sledované proteiny připojené k fluorescenčním proteinům EYFP a Hc-Red-tandem. Těmito vektory byly tranzientně i stabilně transfekovány buňky lidské nádorově transformované linie U-2 OS a to jak jednotlivě, tak i dvěma vektory současně. Na základě primární struktury zkoumaných proteinů byla softwarově odhadnuta jejich buněčná lokalizace. Byla zavedena a optimalizována fluorescenční mikroskopie za podmínek zachovávající viabilitu lidských buněk. Získaná obrazová data byla podrobena počítačovým analýzám korelace distribucí fluorescenčních signálů. Byla také navržena a aplikována zcela nová metoda analýzy toku fluorescenčně značených proteinů mezi jednotlivými oblastmi buňky v obrazových datech. Uvedenými technikami bylo potvrzeno předpokládané umístění proteinů AIF a endoG v mitochondriích. Zároveň byl pozorován a potvrzen proces jejich přemístění z mitochondrie do jádra během apoptózy. Tyto výsledky získané výzkumem na živých buňkách jsou zcela v souladu s již publikovanými výsledky jiných metod. Všechny poznatky, které byly získány o proteinu AMID, vedou k závěru, že protein AMID není lokalizován výhradně na povrchu mitochondrií ani v rozpustné formě v cytoplazmě buněk, jak popisují dosud publikované práce. Nachází se pravděpodobně v cytoplazmě, ale spíše vázán na lipidy buněčných membrán. Jeho role při staurosporinem vyvolané apoptóze v jádře nebyla pozorována, neboť AMID se do jádra nepřemisťoval a nemohl tudíž spolupůsobit při degradaci chromatinu. Role tohoto proteinu v buňce proto zůstává stále neznámou, ale naše výsledky výrazně přispěly k prozkoumání lokalizace a funkce tohoto proteinu a zpochybnily jeho dříve předpokládanou funkci při apoptóze.

Abstract:

The purpose of this thesis was to study the cellular localization and co-localization of proteins AIF, endonuclease G and AMID, which are thought to be involved in caspase-independent apoptosis, as well as to study their assumed translocation into the nucleus during apoptosis induced by the proteinkinase inhibitor staurosporine. We used modern methods, such as primary structure-based bioinformatical prediction of the protein localization, visualisation of cellular proteins through their fusion to fluorescent proteins, living cell fluorescent microscopy and software image analysis. We designed mammalian expression vectors, which carry genes encoding the proteins of interest fused to fluorescent proteins. We managed to transfect human U-2 OS cancer cells both tranziently and stably, as well as to co-transfect them with two expression vectors at once. We predicted the cellular localization of the proteins of interest using software, which analyses the aminoacid sequence of the protein. We accomplished the implementation and optimalization of living cell fluorescent microscopy. The acquired image data were analyzed using software image correlation analysis of the fluorescent signals. We also designed and applied a novel method of analysis of the translocation of the fluorescent proteins between two cell regions on the fluorescent images. Using the listed methods, we managed to confirm the assumed localization of AIF and endoG in the mitochondria. We also observed and confirmed their translocation from mitochondria to the nucleus during the staurosporine-induced apoptosis. Our results obtained on living cells agree with the published results obtained using different methods. All findings indicate, that AMID is not localised exclusively on the outer mitochondrial membrane, neither dissolved in the cytoplasm, as it was observed and published before. It is propably localised to the cytoplasm, but more likely bound to the lipids of the cellular membranes. We did not observe its role in the staurosporine-induced apoptosis, because AMID wasnt transferred into the nucleus and therefore it could not participate in the chromatin degradation process. However the exact role of this protein in apoptosis is therefore still unknown, our results contributed to the comprehension of localization and function of this protein and we also infirmed its assumed function in apoptosis.

Klíčová slova

Apoptóza nezávislá na kaspázách, fluorescenční mikroskopie, živé buňky, fluorescenční proteiny, AIF, endonukleáza G, AMID, caspase-independent apoptosis, fluorescent microscopy, living cells, fluorescent proteins, endonuclease G

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 26. 5. 2006

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 14. 6. 2006
• Vedoucí: Mgr. Miroslav Vařecha, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Molekulární biologie a genetika