Proapoptotické a antiapoptotické faktory během stárnutí oocytů prasete.

Bc. Antonín Kaplan

Master's thesis

Proapoptotic and antiapoptotic factors in the course of porcine oocytes aging.

Abstract:

Proapoptotické a antiapoptotické faktory během stárnutí oocytů prasete Souhrn Kultivace oocytů in vitro je důležitá biotechnologická metoda uplatňující se v běžné praxi in vitro fertilizace (IVF) zvířat i lidí. Ve zralých oocytech vystavených prodloužené kultivaci dochází k řadě biochemických i morfologických změn vedoucích k apoptóze, které jsou mimo jiné charakteristické i mírou exprese proapoptotických a antiapoptotických faktorů rodiny Bcl-2. Tato diplomová práce se zaměřuje na detailnější poznání chování faktorů zapojených do procesu apoptózy během prodloužené kultivace, tedy stárnutí oocytů. Cílem práce bylo ověřit hypotézu, že se během stárnutí prasečích oocytů exprese proapoptotického proteinu Bax zvyšuje, zatímco exprese antiapoptotického proteinu Bcl – xl se snižuje. Za účelem ověření hypotézy byla provedena imunolokalizace proapoptotického faktoru Bax a antiapoptotického faktoru Bcl – xl v prasečích oocytech dozrálých do druhé meiotické metafáze (MII) a následně vystavených prodloužené kultivaci. Míra exprese daného proteinu byla měřena v čase, kdy oocyt dosáhl druhé meiotické metafáze (MII) (0 hodin), a dále po 24, 48 a 72 hodinách. Oocyty byly snímány konfokálním mikroskopem a získané snímky byly hodnoceny analýzou obrazu. Oba proteiny rodiny Bcl – 2, tedy proapoptotický faktor Bax a antiapoptotický faktor Bcl – xl, byly lokalizovány jak v oocytech ve stádiu MII (0 hodin kultivace), tak v oocytech, které byly vystaveny stárnutí během prodloužené kultivace po dobu 24, 48 a 72 hodin. Nejvyšší nárůst exprese proapoptotického faktoru Bax oproti oocytům ve stádiu MII byl naměřen po 24 hodinách kultivace in vitro, takže je zřejmé, že k indukci procesu apoptózy ve stárnoucím oocytu prasete dochází již během prvních 24 hodin stárnutí. Následný postupný pokles exprese poukazuje na degradaci proteinů Bax indukovanou aktivací kaspáz. V případě sledování exprese antiapoptotického markeru Bcl – xl byl pozorován pokles relativní optické intenzity sledovaného signálu proteinu s dobou kultivace in vitro. Tento pokles v expresi je s ohledem na aktivaci proapoptotického faktoru Bcl – xl v prvních 24 hodinách logický. Klíčová slova: Apoptóza, BAX, Bcl-xl

Abstract:

Proapoptotic and antiapoptotic factors during aging of porcine oocytes Summary In vitro oocyte culture is an important biotechnological method used in the common practice of in vitro fertilization (IVF) of animals and humans. A number of biochemical and morphological changes leading to apoptosis occur in mature oocytes exposed to prolonged culture, which are characterized, among other things, by the level of expression of proapoptotic and antiapoptotic factors of the Bcl-2 family. This diploma thesis focuses on a more detailed understanding of the behavior of factors involved in the process of apoptosis during prolonged cultivation, ie oocyte aging. The aim of the study was to verify the hypothesis that during the aging of porcine oocytes, the expression of the proapoptotic protein Bax increases, while the expression of the antiapoptotic protein Bcl - xl decreases. To verify the hypothesis, immunolocalization of proapoptotic factor Bax and antiapoptotic factor Bcl - xl was performed in porcine oocytes matured to the second meiotic metaphase (MII) and subsequently exposed to prolonged culture. The level of expression of a given protein was measured at the time when the oocyte reached the second meiotic metaphase (MII) (0 hours), and then at 24, 48 and 72 hours. Oocytes were scanned with a confocal microscope and the images obtained were evaluated by image analysis. Both Bcl-2 family proteins, proapoptotic factor Bax and antiapoptotic factor Bcl-xl, were localized in both MII-stage oocytes (0 hours of culture) and in oocytes that were aging during prolonged cultivation for 24, 48 and 72 days. hours. The highest increase in proapoptotic factor Bax expression over MII stage oocytes was measured after 24 hours of in vitro culture, so it is clear that induction of the apoptosis process in the aging pig oocyte occurs during the first 24 hours of aging. The subsequent gradual decrease in expression indicates the degradation of Bax proteins induced by caspase activation. In the case of monitoring the expression of the antiapoptotic marker Bcl - xl, a decrease in the relative optical intensity of the monitored protein signal was observed with the time of in vitro culture. This decrease in expression is logical with respect to the activation of the proapoptotic factor Bcl - xl in the first 24 hours. Keywords: Apoptosis, BAX, Bcl-xl

Keywords

BAX, Bcl-xl, Apoptóza

Keywords

Apoptosis, BAX, Bcl-xl

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 4. 5. 2021

Thesis defence

• Supervisor: prof. Ing. Mgr. Markéta Sedmíková, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology