Reakce komplexů osmia s biomakromolekulami a elektrochemie jejich produktů. Nové nástroje pro molekulární biologii.

Ing. Mojmír Trefulka, Ph.D.

Disertační práce

Reactions of Osmium Complexes with Biomacromolecules and Electrochemistry of Their Products. New Tools for Molecular Biology.

Anotace:

Disertační práce se zabývá modifikací některých nukleosidů, oligonukleotidů, nukleových kyselin, sacharidů a glykoproteinů (např. avidinu) komplexy osmimocného a šestimocného osmia s dusíkatými ligandy [Os(VIII)L, Os(VI)L]. Byly studovány především elektrochemické vlastnosti získaných osmiem modifikovaných produktů a možnosti přípravy monoklonálních protilátek proti sacharidovým molekulám modifikovaným Os(VI)L. (1) Bylo zjištěno, že v případě modifikace nukleosidů a oligonukleotidů činidlem Os(VIII)bipy (bipy = 2,2’-bipyridyl) se modifikují výhradně pyrimidinové báze, zatímco činidlo Os(VI)bipy modifikuje v prostředí bez kyslíku výhradně cukerné zbytky ribonukleosidů (ribonukleotidů). Elektrochemická měření byla prováděna na rtuťové, uhlíkové, a některá i na zlaté elektrodě. Produkty s Os(VI)L modifikovaným cukerným zbytkem jsou elektrochemicky aktivní, a dávají podobné, ale nikoliv identické elektrochemické odezvy, jako nukleosidy a DNA s Os(VIII)L modifikovanými bázemi. (2) Modifikace reportérové DNA (RP-DNA) pomocí Os(VIII)L byla využita ke stanovení hybridizace s cílovou DNA (target DNA, tDNA) na elektrodách z pyrolytického grafitu. Rozdílný elektrochemický potenciál píků Os(VIII)L modifikované DNA při použití různých ligandů L umožnil simultánně testovat jednu tDNA pomocí více RP-DNA. (3) Sacharidy a jejich deriváty, včetně oligoribonukleotidů s volným 3’ koncem a glykoproteinů, je možno modifikovat Os(VI)L. Jako ligand L je při modifikacích Os(VI)L vhodnější N,N,N´,N´- tetramethylethylendiamin (temed) než bipy. Os(VI)L modifikované sacharidy jsou elektrochemicky aktivní a jejich elektrochemické chování je v mnohých rysech podobné elektrochemickým vlastnostem Os(VIII)L modifikovaných nukleových kyselin a proteinů. (4) V případě glykoproteinu avidinu dochází účinkem Os(VI)L k modifikaci sacharidové složky, na rozdíl od modifikace účinkem Os(VIII)bipy, kdy dochází k modifikaci tryptofanových zbytků. Modifikace avidinu účinkem Os(VI)L nemá na rozdíl od modifikace účinkem Os(VIII)bipy vliv na schopnost avidinu vázat biotin. (5)Imunizací myší pomocí Os(VI)temed modifikovaným kvasinkovým mannanem byly připraveny monoklonální protilátky specifické pro sacharidové molekuly modifikované Os(VI)L. Tyto protilátky reagují obecně se sacharidovými molekulami modifikovanými Os(VI)L, dokáží rozpoznat mimo jiné avidin a oligoribonukleotid rA10 modifikované Os(VI)temed. Většina klonů reaguje rovněž s Os(VIII)L modifikovanou DNA, nikoliv však s Os(VIII)bipy modifikovaným avidinem. Jeden z připravených klonů byl specifičtější, a reagoval pouze s Os(VI)temed modifikovanými sacharidovými strukturami a nikoliv s Os(VIII)L modifikovanou DNA, nebo sacharidy modifikovanými Os(VI)L, jestliže L byl jiný ligand než temed. Výše uvedené výsledky ukazují nové možnosti chemické modifikace biomakromolekul, a zvláště polysacharidů, glykoproteinů a RNA. Tyto modifikace jsou použitelné k elektroaktivnímu značení těchto látek, a zvláště ke koncovému značení RNA. Takovéto značení lze využít v moderních biotechnologiích, a zvláště v biosenzorech. Specifické monoklonální protilátky najdou uplatnění při analýze biomakromolekul jak in vitro tak in vivo.

Abstract:

The aim of this thesis is the investigation of modification of some nucleosides, nucleotides, nucleic acids, saccharides and avidin with nitrogen ligand complexes of eight and six valent osmium [Os(VIII)L, Os(VI)L]. Especially electrochemical behavior of osmium modified products was studied. The preparation of monoclonal antibodies against osmium modified saccharides is also described. (1) In the case of modification of nucleosides and oligonucleotides with Os(VIII)bipy (bipy = 2,2’-bipyridyl) only the pyrimidine bases are modified, while Os(VI)bipy modifies in absence of oxygen the saccharide residues of ribonucleosides (ribonucleotides) only. Electrochemical measurements were performed at mercury, carbon, and some at gold electrodes. The products which contain Os(VI)L modified sugar residues are electrochemically active, producing similar but not identical electrochemical responses as the base-modified ribosides and DNAs. (2) The modification of reporter DNA (RP-DNA) with Os(VIII)L has been utilized in the assay of hybridization with target DNA (tDNA) at pyrolytic graphite electrodes. The different potential of electrochemical peaks of Os(VIII)L modified DNA depends on the kind of the ligand L, and enables parallel testing of single tDNA with several RP-DNAs. (3) It is possible to modify saccharides and their derivatives, including ribonucleotides with free 3' end and glycoproteins, with Os(VI)L. N,N,N´,N´- tetramethylethylenediamine (temed) appears as better ligand than bipy in modifications with Os(VI)L. Saccharides modified with Os(VI)L are electrochemically active and their electrochemical behavior is similar to the electrochemical behavior of Os(VIII)L modified nucleic acids and proteins. (4) In the case of glycoprotein avidin, treatment with Os(VI)L lead to the modification of the saccharide moiety, while treatment with Os(VIII)bipy lead to modification of tryptophan residues. Modification of the saccharide moiety of avidin with Os(VI)L does not affect the ability of avidin to bind biotin in contrast to modification of tryptophan residues with Os(VIII)bipy. (5) The monoclonal antibodies were prepared using immunization of mice with Os(VI)temed modified yeast mannan. These antibodies recognize Os(VI)L modified saccharide structures, including Os(VI)temed modified avidin and oligoribonukleotide rA10. Most clones of these antibodies recognize Os(VIII)L modified DNA too, but do not recognize Os(VIII)bipy modified avidin. One of the clones prepared is more specific and recognizes only Os(VI)temed modified saccharide structures and do not recognize Os(VIII)L modified DNA or Os(VI)L modified saccharide structures if L is other ligand then temed. The results mentioned above pave the way for new approaches of chemical modification of biomacromolecules, especially polysaccharides, glycoproteins and RNAs. These modifications are applicable in electrochemical labeling of these compounds, in particular for end-labeling of RNAs. Such labeling is applicable in modern biotechnologies, especially in biosensors. The specific monoclonal antibodies can be utilized in the analysis of biomacromolecules in vitro and in vivo.

Klíčová slova

Nukleové kyseliny, proteiny, sacharidy, osmium, modifikace biomolekul komplexy osmia, elektrochemie, elektroaktivní značky biomolekul, imunochemie, protilátky, Nucleic acids, Proteins, Saccharides, Modification of biomolecules with osmium complexes, Electrochemistry, Electroactive labels of biomolecules, Immunochemistry, Antibodies

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 15. 2. 2008

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 15. 2. 2008
• Vedoucí: prof. RNDr. Emil Paleček, DrSc.
• Oponent: prof. RNDr. Jiří Fajkus, CSc., prof. RNDr. Stanislav Zadražil, DrSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biologie (čtyřleté) / Molekulární a buněčná biologie