Charakterizace a využití kvasinkového in vitro modelu pro hodnocení estrogenního potenciálu látek

Bc. Veronika Buráňová

Master's thesis

Characterization and use of the yeast in vitro model for assessment of estrogenicity

Abstract:

Předložená diplomová práce se zabývá problematikou estrogenního potenciálu látek a možnými způsoby jeho testování se zaměřením na dostupné kvasinkové in vitro modely, které byly pro tento účel zkonstruovány. Podrobný přehled těchto modelů včetně jejich citlivosti a koncových parametrů měření je uveden v teoretické části. V praktické části práce je důkladně charakterizován kvasinkový in vitro model s koncovkou měření bioluminiscence, jenž je dostupný v laboratořích výzkumného Centra pro výzkum toxických látek v prostředí. Výsledky prokázaly podobnou míru variability v odpovědích jak mezi jednotlivými rozkultivovanými zásobními kulturami, tak v rámci jedné opakovaně rozkultivované zásobní kultury. Dále byla srovnána zjištěná citlivost na 17-estradiol s citlivostí dalších kvasinkových in vitro modelů publikovanou v zahraniční vědecké literatuře. Bylo prokázáno, že citlivost na 17-estradiol (mediánové hodnoty LOEC 15 pM, EC50 338 pM, indukční faktor (IF) 1,99 pro ERa LOEC 137 pM, EC50 360 pM a IF 1,81 pro ER je srovnatelná s citlivostí publikovanou v zahraniční vědecké literatuře a to u modelů se stejnou i odlišnou koncovkou měření. Součástí experimentální části bylo také hledání modifikací standardního postupu ve smyslu zkrácení testovací procedury či zvýšení citlivosti používaného modelu. Výsledky prokázaly, že je možné vynechat 2-hodinovou preinkubaci a rovnou zvýšit počet kvasinek na požadované počáteční množství, aniž by to ovlivnilo citlivost a výslednou odpověď na kalibrační řadu 17-estradiolu. Dále bylo zjištěno, že kultivací kvasinek v minimálním médiu, které bylo oproti stávajícímu složení obohaceno o AMK tryptofan a uracil a jehož pH bylo upraveno na 5,6, bylo dosaženo velmi nízké pozaďové hodnoty luminiscence a vysokých indukčních faktorů. V neposlední řadě vezme-li v potaz časovou náročnost expozice, představuje kvasinkový in vitro model s bioluminiscenční koncovkou nejlepší alternativu.

Abstract:

This thesis deals with the xenoestrogenic potential of substances and methods of its testing, focusing on the available yeast in vitro models that were designed for this purpose. The goal of the practical part was to thoroughly characterize the yeast in vitro model, which is modified to measure bioluminiscence as an endpoint and which is available in laboratories of the Research Centre for Toxic Compounds in the Environment in frozen stock. Another objective was to compare its sensitivity to 17-estradiol with the sensitivity of other yeast in vitro models for assessment of estrogenicity described in foreign scientific literature. The results showed good reproducibility and relatively low degree of variability both among frozen cultures from individual frozen stocks, and also within colonies originating from one frozen stock. Furthermore, the sensitivity to 17 -estradiol was comparable to that published in foreign scientific literature (median values: LOEC 15 pM, EC50 338 pM, induction factor (IF) 1.99 for ER  and LOEC 137pM, EC50 360 pM and IF = 1.81 for ER , respectively). Another objective of the experimental part was to assess modifications of the standard procedure with the aim of shortening the test procedure and increasing the sensitivity of the test model. The results show that it is possible to omit the 2-hour preincubation –and directly increase the initial number of yeast cells, without affecting the sensitivity and the resulting response to the calibration range of 17 -estradiol. Furthermore it was found that cultivation of yeasts in minimal medium enriched with AMK tryptophane and uracile in which pH was adjusted to 5,6 resulted in very low background levels of luminiscence and high levels of IF. Finally, when taking into account the exposure time required yeast in vitro model with bioluminiscent endpoint measurement is one of the best alternatives.

Keywords

kvasinky, in vitro modely, xenoestrogenní potenciál

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 11. 1. 2012

Thesis defence

• Date of defence: 14. 2. 2012
• Supervisor: prof. RNDr. Luděk Bláha, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / General Biology