Využití fungicidů ke studiu orchideoidní mykorhizy

Ing. Kristýna Balážová, Ph.D.

Doctoral thesis

Study of orchid mycorrhiza using fungicides

Abstract:

Přestože mykorhiza orchidejí je objektem studia již od 19. století, mnohé aspekty jejího fungování nejsou uspokojivě objasněny dodnes. Jednou z příčin tohoto stavu je absence metody, s jejíž pomocí by bylo možné připravovat rostliny s omezeným rozvojem mykorhizní symbiózy. Takové rostliny jsou nezbytné v mnoha typech pokusů týkajících se např. role orchideoidní mykorhizy (OM) v příjmu minerálních živin či vody, v ovlivnění růstu hostitelských rostlin a kompetičních vztahů s jinými rostlinnými druhy, nebo při sledování vzájemné výměny uhlíkatých látek mezi oběma asociovanými organismy. Cílem této disertační práce bylo otestovat vybrané fungicidy na jejich schopnost potlačit růst, popřípadě snížit vitalitu mimokořenového mycelia (ERM) OM hub. Dalším cílem bylo, již s využitím vhodného fungicidního ošetření rostlin, kvantifikovat uhlíkatou výživu jak zelené, fotosyntetizující orchideje, tak mimokořenového mycelia s ní asociované mykorhizní houby. Jako fungicidy zvolené pro testování v mých experimentech byly použity látky ze skupiny benzimidazolů, blokující v houbách biosyntézu ß-tubulinu. Thiabendazol (10 mg•l-1 – TBZ 10 nebo 50 mg•l-1 - TBZ 50) byl zvolen z důvodu jeho úspěšné aplikace na OM ve třech studiích z 80. let minulého století. Benomyl (1 g•l-1) byl testován jakožto fungicid nejběžněji používaný k redukci rozvoje arbuskulární mykorhizy. Eradikativní efekt benomylu i TBZ 10, hodnocený jako poměrná délka mimokořenového mycelia (ERM) vykazující NADH-dehydrogenázovou aktivitu, byl v případě jeho aplikace do laterálních hyfoboxů v rámci rhizoboxového systému statisticky neprůkazný. Pokud však jimi bylo ošetřeno vyextrahované ERM (24 hod in vitro), TBZ 10 snížil vitalitu mycelia na 19 % hodnoty kontroly. Vrůstání mycelia do fungicidem nasyceného substrátu v hyfoboxech (rhizoboxový systém) bylo sledováno kombinací extrakce ERM metodou vložené membrány, barvení trypanovou modří v laktoglycerolu a vyhodnocením jeho délky na mikrofotografiích. Ve dvou nezávislých experimentech, využívajících druhy Serapias lingua, Orchis italica a Ophrys ciliata, benomyl a TBZ 50 zcela eliminovaly růst ERM, zatímco TBZ 10 nebyl účinný. Přestože na základě mých výsledků se zdálo, že jako komerční preparát snadno dostupný benomyl je vysoce účinný v inhibici růstu ERM, následné výsledky mé a mých následovníků ukázaly, že efektivita nejen jeho, ale i dalších fungicidů se může velmi výrazně změnit 1) s dobou aplikace – pro větší účinek je nutné je aplikovat fungicidy před rozvojem mykorhizní symbiózy; 2) s koncentrací dané látky; 3) s místem aplikace – pokud je aplikována do celého objemu mykorhizosféry, je daná látka výrazně méně účinná než při aplikaci do bočního hyfového oddělení v rhizoboxovém systému; 4) s obsahem organické hmoty v substrátu – ať již rozkládající se kořeny kukuřice, nebo přídavek rašelinného substrátu výrazně snížily až anulovaly efektivitu některých fungicidů. Uhlíkatá výživa orchideje Serapias strictiflora (C3 rostlina) a jejího symbionta Epulo¬rhiza sp. byla kvantifikována pomocí izotopového složení uhlíku (δ13C) jejich pletiv či ERM. V experimentu byly jako zdroj pro potencionální saprotrofní výživu OM houby použity rozkládající se kořeny kukuřice (C4 rostlina). Výsledky neprokázaly, že by se na výživě dospělých fotosyntetizujících rostlin S. strictiflora podílela mykoheterotrofie. Izotopové složení ERM asociovaného pouze se S. strictiflora reflektovalo jeho plně biotrofní výživu, zatímco pokud byly v substrátu kořeny kukuřice, OM houba je kolonizovala a podíl její výživy byl (ve smyslu látkového množství C) 31 % saprotrofie ku 69 % biotrofie. Tyto výsledky jsou dle našich znalostí prv

Abstract:

ní, které umísťují C výživu ERM jakéhokoliv typu mykorhizy do kontinua biotrofie-saprotrofie.

Abstract:

In spite of more than a century lasting research on orchid mycorrhiza, many aspects of its functioning were not elucidated adequately till now. One of the reasons of this situation is the lack of the method suitable for creation of plants with restricted development of orchid mycorrhiza (OM). These plants are a prerequisite for many types of experiments studying e.g. the role of OM in mineral nutrients or water uptake by orchids, effects on orchid growth and competition abilities or quantifying exchange of carbon compounds between the partners associated in OM. Aims of this Ph.D. thesis were 1) to test selected fungicides on their abilities to stop growth or to decrease the viability of extraradical mycelia (ERM) of OM fungi; 2) using a suitable fungicidal treatment, to quantify carbon nutrition of green-leaved photosynthesizing orchid Serapias strictiflora and the mycorrhizal Epulorhiza sp. ERM associated with it. Benzimidazoles, i.e. compounds inhibiting biosynthesis of ß-tubulin were tested in my experiments. Thiabendazole (10 mg•l-1 - TBZ 10 or 50 mg•l-1 - TBZ 50) was chosen as it was successfully used in three studies on OM in the eighties. Benomyl (1 g•l-1) was tested because its common use for the reduction of arbuscular mycorrhiza. Eradicative effect of benomyl and TBZ 10, assessed as the ERM relative length showing NADH-dehydrogenase activity, was not observed when these fungicides were applied on fully developed ERM in lateral hyphoboxes (a part of rhizobox system). If benomyl and TBZ 10 were used to treat extracted ERM (24 hrs, in vitro), TBZ 10 decreased the ERM viability substantially, to 19% of controls. The growth of mycelia into hyphoboxes filled with substrate pre-soaked with fungicides were assessed using inserted membrane technique for extraction, staining of the ERM by trypan blue in lactoglycerol and quantifying the ERM length using microphotographs. In two independent experiments using Serapias lingua, Orchis italica and Ophrys ciliata as host species, benomyl a TBZ 50 eliminated the ERM growth, while TBZ 10 did not. Based on these two experiments, we suggested benomyl as highly efficient fungicide capable to stop growth of the ERM. However, the results of following experiments showed that the efficiency not only of benomyl, but also of other fungicides change substantially depending on 1) application timing – for sufficient effect it is necessary to apply fungicides before the mycorrhiza is established; 2) fungicide concentration; 3) point of application – if applied to whole mycorrhizosphere volume, the fungicides were much less effective compared to application into lateral hyphoboxes only; 4) content of organic matter in the substrate – both decaying maize roots or addition of peat-based substrate reduced or nullified efficiency of some fungicides. Carbon nutrition of the orchid S. strictiflora (C3 plant) and its mycorrhizal symbiont Epulorhiza sp. was quantified using carbon isotopes composition (δ13C) of their tissues. The decaying maize roots (C4 plant) were used as a complex source of carbon compounds for potential fungal saprotrophy. The results did not confirm any contribution of myco¬heterotrophy to the carbon nutrition of adult photosynthesizing S. strictiflora plants. The isotopic composition of the ERM associated with orchid roots only reflected full fungal biotrophy. However, when the fungus had access to and colonized the decaying maize roots, its nutrition was (in term of amount of carbon substance) 31% saprotrophy and 69% biotrophy. This result is to my best knowledge the first exact placement of the ERM from any mycorrhizal association into the biotrophy-saprotrophy continuum.

Keywords

fungicidy, mimokořenové mycelium, mykorhiza, Orchidaceae, δ13C, extraradical mycelia, fungicides, mycorrhiza

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 2. 9. 2009

Thesis defence

• Date of defence: 29. 9. 2009
• Supervisor: prof. RNDr. Jan Gloser, CSc.
• Reader: RNDr. Miroslav Vosátka, CSc., doc. Dr. Ing. Libor Jankovský

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Plant Anatomy and Physiology