Elucidation of the role of RNA editing enzyme Adar in Drosophila

Anzer Khan, M.Sc.

Doctoral thesis

Abstract:

ADAR RNA editující enzymy deaminují adenosin na inosin ve dvouřetězcové RNA. Inosin je během translace obvykle překládán jako guanosin, díky čemuž dochází k diverzifikaci proteinů přítomných v organismu. ADARy byly poprvé biochemicky popsány před 30 lety. Rozličné modelové organismy nám poodhalily rozsah biologických účinků ADAR enzymů jak během vývoje, tak i v normálních fyziologických funkcích. Zatímco obratlovci mají více ADAR genů, genom Drosophila kóduje pouze jeden Adar gen, který je ortologní k lidskému ADAR2, díky čemu lze expresí lidského ADAR2 zvrátit Adar mutantní fenotyp u Drosophila. Tato doktorská práce se zabývá objasněním role Adar u Drosophila melanogaster V kapitole 2 zkoumám membránové a synaptické defekty vedoucí k neurodegeneraci u Adar mutantní Drosophila, které lze zvrátit zvýšenou autofagickou aktivitou. Mutantní mouchy Adar5G1 null vykazují sníženou životaschopnost, poruchy hybnosti, sterilitu u samců a rozvíjí se u nich na věku závislá neurodegenerace. Genetický screening provedený dřívějším PhD studentem v naší skupině odhalil, že Adar5G1 mutantní fenotyp je potlačen pomocí redukce exprese Tor nebo zvýšené exprese Atg5. Zjistil jsem, že náprava Adar5G1 mutantního fenotypu není závislá na kanonické autofágii, ale na endozomální mikroautofágii (eMI), což je jiná dráha autofágie, která je zapojená v synaptické homeostáze u Drosophila. Zvýšenou expresí klíčového proteinu eMI, Hsc70-4, dochází k potlačení Adar5G1 mutantního fenotypu. V kapitole 3 se zaměřuji na funkce Adar závislé a nezávislé na editaci RNA, které jsou nezbytné pro správnou funkci mozku a vrozené imunity u Drosophila. U obratlovců je editační aktivita ADAR1 nezbytná pro rozpoznání vlastní dsRNA od cizorodé dsRNA. ADAR1 editace může vést ke vzniku I-U párů bazí v dsRNA, které brání aberantní aktivaci antivirového dsRNA senzoru MDA5, který patří mezi tzv. RIG-I-like receptory (RLR). Proto je ADAR1 nepostradatelný pro vrozenou imunitu obratlovců. Přestože je Adar Drosophil ortologní k ADAR2, má podobnou funkci ve vrozené imunitě jako ADAR1, protože ztráta RNA editace vede k indukci vrozené imunitní odpovědi u Adar5G1 mutantních much. Takto indukovaná imunitní odpověď může být potlačena umlčením exprese dsRNA senzoru Dicer-2, který náleží do stejné rodiny DEAD box helikáz jako MDA5. Dále pak přináším potvrzení, že Adar je nezbytný pro normální pohyblivost a brání na věku závislé neurodegeneraci. Katalyticky neaktivní Adar, pokud je exprimován ve vyšší než fyziologické míře, může zabránit neurodegeneraci u Adar mutantů, což nasvědčuje o jeho funkci nezávislé na editaci RNA. V kapitole 4 popisuji novou funkci Adar v metamorfóze Drosophila. V této studii jsme provedli genetický screening, který odhalil účinek Adar na kritického regulátora vývoje Drosophila, ekdyzonovou signalizaci. Ubikvitární exprese Adar s pomocí act5c-Gal4 promotoru vede k úmrtí ve fázi kukly s defekty v everzi hlavy a ekdyzi. Letalitě způsobené ubikvitární expresí Adar může být zabráněno prostřednictvím potlačení syntézy ekdyzonu a utlumením jeho signálních drah. Tkáňově specifická naderexprese Adar v prothorakálních žlázách (PG) pomocí phm-Gal4 způsobuje prodloužení larválního stádia a značně opožděné zakuklení provázené velkým poklesem hladiny transkriptů kódujících enzymy pro syntézu a signální dráhy ekdyzonu v PG. Tyto defekty jsou způsobeny RNA editačně dependentní aktivitou Adar. Dle naší hypotézy je exprese Adar v Drosophila důležitá pro regulaci signalizace ekdyzonu během metamorfózy.

Abstract:

ADAR RNA editing enzymes deaminate adenosine bases to inosines in double-stranded RNA. During translation, inosine is usually read as guanosine and this diversifies the proteins present in the organism. ADARs were first identified biochemically over 30 years ago and different genetic model organisms have revealed the range of the biological effects ADAR enzymes have in development as well as in normal physiological function. In vertebrates, there are multiple ADAR genes whereas Drosophila encodes one Adar gene which is an orthologue of human ADAR2, as Drosophila Adar mutant phenotype can be rescued by human ADAR2 expression. This thesis focusses on elucidating the roles of Adar in Drosophila melanogaster. Chapter 2 of the thesis investigates membrane and synaptic defects that lead to neurodegeneration in Adar mutant Drosophila, which is rescued by increased autophagy. Adar5G1 null mutant flies show low viability, locomotion defects, male-sterility and develop age-dependent neurodegeneration. A genetic screen by a previous PhD student in the group revealed that Adar5G1 mutant phenotypes are suppressed by reducing the expression of Tor or increasing expression of Atg5. I demonstrated that the rescue of Adar5G1 mutant phenotypes was not dependent on canonical autophagy but endosomal microautophagy (eMI) which is another autophagy pathway involved in synaptic homeostasis in Drosophila. Increased expression of the key eMI protein Hsc70-4 suppresses Adar5G1 mutant phenotypes. Chapter 3 of the thesis focuses on the RNA editing-dependent and -independent roles of Adar that are required for brain and innate immune functions in Drosophila. In vertebrates, editing by ADAR1 is essential to discriminate between self and non-self dsRNA. ADAR1 editing can generate I-U base pairs in dsRNA, which prevents the aberrant activation of the antiviral dsRNA sensor MDA5 which is a RIG-I-like receptor (RLR). Thus, ADAR1 is essential for innate immunity in vertebrates. Drosophila Adar, despite being an orthologue of ADAR2, has a similar function in innate immunity as ADAR1, since the loss of RNA editing leads to innate immune induction in the Adar5G1 mutant flies. The induction of this innate immune response can be suppressed by silencing the dsRNA sensor Dicer-2 which belongs to the same DEAD box helicase family as MDA5. We also demonstrate that Adar is necessary for normal locomotion and prevents age-dependent neurodegeneration. The catalytically inactive Adar, when expressed at a higher than physiological level, can rescue neurodegeneration in Adar mutants, suggesting also editing-independent effects. Chapter 4 describes a novel role for Drosophila Adar in metamorphosis. In this study, we performed a genetic screen that has revealed an effect of Adar on ecdysone signaling, a crucial regulator of Drosophila development. Ubiquitous expression of Adar with the act5c-Gal4 driver results in pupal lethality with defects in head eversion and ecdysis. The lethality caused by ubiquitous expression of Adar can be rescued by blocking ecdysone synthesis and signaling. Tissue-specific overexpression of Adar in the prothoracic gland (PG) with phm-Gal4 causes extended larval life with a long delay in pupation, with major reductions in PG transcripts encoding enzymes involved in ecdysone synthesis and signaling. The defects are due to RNA editing-dependent role of Adar. We hypothesize that Adar expression in Drosophila is a prerequisite to regulate ecdysone signaling during metamorphosis

Keywords

Adar, Drosophila, Immunity, Autophagy, RNA modification, Development, Ecdysone signaling

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 27. 7. 2020

Thesis defence

• Date of defence: 2. 10. 2020
• Supervisor: prof. Mary Anne O'Connell, PhD.
• Reader: doc. Mgr. Tomáš Doležal, Ph.D., prof. RNDr. Marek Jindra, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biomolecular chemistry and bioinformatics / Biomolecular chemistry and bioinformatics