Molekulární faktory osteogeneze se zaměřením na nové funkce kaspáz

Mgr. Adéla Kratochvílová, Ph.D.

Doctoral thesis

Molecular factors driving osteogenesis – novel functions of caspases

Abstract:

Osteogeneze je proces vzniku a vývoje kostí, které obsahují tři základní typy buněk. Osteoblasty vytváří extracelulární matrix, ta mineralizuje a obklopuje osteocyty. Osteoklasty se podílí na degradačním procesu při remodelaci kostí. Dizertační práce je zaměřena na osteoblasty a jejich diferenciaci do osteocytů. Kaspázy jsou enzymy z rodiny cysteinových proteináz, které kromě klasických rolí v apoptóze a zánětu vykazují celou řadu dosud neprobádaných funkcí. První část prezentovaného výzkumu se věnuje vlivu inhibice kaspáz v buňkách osteoblastové linie MC3T3-E1 na jejich osteogenní profil. Primárním zjištěním byla modulace exprese klíčového osteogenního markeru, osteokalcinu. V navazujícím kroku byl s využitím specifických inhibitorů prokázán výrazný efekt inhibice kaspázy-8 na jeho expresi. Tradičním spouštěčem aktivace kaspázy-8 v apoptotických drahách je FasL/Fas signalizace, jejíž zapojení i mimo apoptózu je však stáje zřejmější. Další část výzkumu se proto zaměřila na toto nové spektrum funkcí FasL. Použita byla osteoblasto-cytová linie IDG-SW3, u které byl po stimulaci FasL zaznamenán výrazný účinek na expresi sklerostinu, hlavního markeru osteocytů. Navazující analýza s využitím obecného kaspázového inhibitoru prokázala, že k poklesu sklerostinu po stimulaci FasL dochází i v inhibovaných buňkách. Zřejmě je tedy aktivována alternativní dráha ovlivňující diferenciaci osteocytových buněk. Vzhledem k tomu, že sklerostin je negativním regulátorem osteogeneze a FasL/Fas je jedním z terapeutických cílů například u osteoporózy, jedná se o zajímavý nález pro základní i aplikovaný výzkum. Závěrečná část dizertační práce je zaměřena na kaspázu-12, patřící mezi méně probádané kaspázy. Její přítomnost byla hodnocena jak u buněk MC3T3-E1, tak v kraniofaciálních kostech, ze kterých je tato linie odvozena. Také po inhibici této kaspázy se prokázal vliv na expresi osteokalcinu. Předložená práce prezentuje nové poznatky ke kaspázám a Fas ligandu jako molekulárním faktorům osteogeneze, a to formou komentovaného souboru tří původních vědeckých článků, které byly zveřejněny v impaktovaných vědeckých časopisech kategorie Q1.

Abstract:

Osteogenesis is the process of formation and development of bone, which consists of three basic types of cells. Osteoblasts create a matrix that mineralises and surrounds osteocytes. Osteoclasts participate in the degradation process of bone remodelling. This doctoral thesis is mainly focused on osteoblasts and their differentiation into osteocytes. Caspases are enzymes from the family of cysteine proteases, which, in addition to classical roles in apoptosis and inflammation, also show a number of as yet unexplored functions in osteogenesis. The first part of the presented research follows up the effect of caspase inhibition in cells of the osteoblastic cell line MC3T3-E1 to their osteogenic profile. The initial finding was a modulation of the expression of a key osteogenic marker, osteocalcin. In the following step, using specific inhibitors of proapoptotic caspases, the significant effect of caspase-8 inhibition on its expression was detected. A conventional initiator of caspase-8 activation in apoptotic pathways is FasL/Fas signalling, but its involvement in processes beyond of apoptosis is becoming increasingly apparent. The next part of the research therefore focused on this new spectrum of FasL functions. The osteoblastic/osteocytic cell line IDG-SW3 was used and the significant influence of FasL stimulation on the expression of sclerostin, the principal marker of osteocytes, was observed. Subsequent analysis with the use of a general caspase inhibitor showed a decrease of sclerostin expression following FasL stimulation in inhibited cells as well. Thus, an alternative pathway affecting the differentiation of osteocytic cells is apparently activated. Given that sclerostin is a negative regulator of osteogenesis and FasL/Fas is one of the therapeutic targets in osteoporosis, for example, this is an interesting finding for both basic and applied research. The final part of the doctoral thesis is focused on caspase-12, which belongs to less studied caspases. Its presence was evaluated in both MC3T3-E1 cells and in the craniofacial bones from which this line is derived. Osteocalcin expression has also been shown to be affected by the inhibition of this caspase. The submitted work presents new findings on caspases and Fas ligand as molecular factors of osteogenesis, in the form of a commented set of three original research articles, which were published in category Q1 impacted scientific journals.

Keywords

osteoblast, osteocyt, diferenciace, kaspázy, Fas/FasL signalizace, neapoptotický efekt, osteocyte, differentiation, caspases, Fas/FasL signalling, nonapoptotic effect

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 2. 2022

Thesis defence

• Date of defence: 25. 3. 2022
• Supervisor: prof. RNDr. Eva Matalová, Ph.D.
• Reader: Mgr. Stjepan Uldrijan, CSc., prof. Ing. Tomáš Urban, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Molecular and Cell Biology and Genetics / Molecular and Cell Biology and Genetics