Imunomonitoring protinádorové odpovědi u vybraných hematoonkologických malignit

MUDr. Lenka Zahradová, Ph.D.

Doctoral thesis

Immunomonitoring of anticancer response in chosen hematological malignancies

Abstract:

Úvod: Mnohočetný myelom (MM) je hematologické nádorové onemocnění, které je současnými léčebnými možnostmi nevyléčitelné. Jednou z nových cest léčby je využití potenciálu vlastního organismu nemocného. V posledních letech se rozšiřují znalosti o antigenech asociovaných s nádory, o vlastnostech, funkcích a interakcích imunokompetentních buněk, efektu různých cytokinů – objevují se tak četné druhy potenciálně účinných protinádorových vakcín. S rozšiřujícím se spektrem možností stoupá na důležitosti monitorace imunitního systému k posouzení účinosti dané vakcíny. Za zásadní se považuje protinádorový efekt specifických cytotoxických T lymfocytů, a je tudíž žádoucí ověřit jejich cytotoxický potenciál in vitro. Cíle: Cílem práce bylo zhodnocení imunologického potenciálu organismu v boji proti nádorovým buňkám v in vitro a in vivo podmínkách u MM. Jedním z cílů bylo zavést cytotoxický test pro účely hodnocení cytolytické aktivity specifických cytotoxických T lymfocytů a ověřit specificitu a cytolytický efekt potenciálně cytotoxických T lymfocytů v alogeních a autologních podmínkách s využitím nádorových myelomových buněk. Dalším cílem bylo vyhodnocení kvality, bezpečnosti a klinického a imunologického efektu podání dvou typů protinádorových vakcín u nemocných s MM. Metodika a výsledky: 1. Byl optimalizován neradioaktivní cytotoxický test k hodnocení cytotoxického potenciálu specifických cytotoxických T lymfocytů vůči nádorovým buňkám. Populace nádorových (terčových) buněk byla odlišena od populace T lymfocytů (efektorových buněk) pomocí barvení T lymfocytů barvivem CFSE. Jako netoxická barvící koncentrace CFSE, která dovoluje spolehlivé rozlišení obou populací byla stanovena koncentrace 1uM. Optimální poměr efektorových a terčových buněk byl stanoven na 10:1, optimální doba kultivace ve smíšené lymfocytární reakci 24 hodin. Mrtvé buňky byly odlišeny pomocí barviva PI nebo 7-AAD. Test byl hodnocen průtokovým cytometrem. 2. Optimalizovaným cytotoxickým testem byl hodnocen cytotoxický efekt in vitro připravených potenciálně cytotoxických T lymfocytů v alogenních podmínkách s využitím nádorové myelomové linie ARH 77 a T lymfocytů od zdravých dárců získaných z buffy coatu. Potenciálně cytotoxických T lymfocytů byly identifikovány jako INF-γ pozitivní frakce po stimulaci nádorovým antigenem (apoptotickými tělísky buněk linie ARH 77). Bylo prokázáno, že specifické cytotoxické T lymfocyty vykazují vyšší cytotoxický potenciál vůči buňkám nádorové linie ARH 77 ve srovnání s efektem vůči alogenním mononukleárním buňkám (MNC) a ve srovnání s efektem INF-γ negativní frakce T lymfocytů vůči buňkám linie ARH 77. 3. Dále byla stejným testem hodnocena cytotoxicita potenciálně specifických cytotoxických T lymfocytů v autologních podmínkách s využitím nádorových myelomových buněk získaných z odběru kostní dřeně nemocných s MM a T lymfocytů získaných z periferní krve stejných nemocných. Specifické T lymfocyty byly připraveny po stimulaci autologními dendritickými buňkami (DB) naloženými apoptotickými tělísky autologních myelomových buněk. Podařilo se prokázat cytotoxický potenciál specifických T lymfocytů vůči nádorovým myelomovým buňkám, T lymfocyty vykazovaly také cytotoxický efekt vůči buňkám nádorové myelomové linie ARH 77. Na druhou stranu specifické cytotoxické T lymfocyty vykazovaly minimální cytotoxický potenciál vůči alogenním MNC. 4. V rámci klinické studie fáze I/II byla 12-ti nemocným s MM podána první protinádorová vakcína v České republice schválená Státním ústavem pro kontrolu léčiv. Vakcína spočívala v i.d. podání autologního purifikovaného Id-proteinu spolu imunogenem KLH a inte

Abstract:

rleukinem 2. Bylo podáno 6 vakcín v měsíčních intervalech. Nebyly pozorovány nežádoucí účinky související s aplikací vakcíny až na nezávažnou kožní reakci v místě vpichu. Imunologická reakce na vakcínu byla hodnocena ELISpotem, proliferačním tymidinovým testem a kožním DTH testem. ELISpot a tymidinový test byl pozitivní u 2/12 nemocných, kožní test byl pozitivní u všech 7/7 hodnocených nemocných, u 4 z nich byla výraznější reakce na Id-protein než na KLH. Klinická odpověď na vakcínu nebyla pozorována. Výsledky jsou obdobné jako výsledky klinických studií prováděných v jiných zahraničních centrech. 5. Druhá zkoušená vakcína podávaná v rámci klinické studie fáze II sestávala z autologních DB naložených autologním Id-proteinem. Vakcína byla podána i.d. 6x v měsíčních intervalech 11-ti nemocným s MM. Obdobně jako u předchozí vakcíny nebyly, až na lokální reakci v místě injekce, zaznamenány nežádoucí účinky. Imunologická odpověď metodou ELISpot byla u 1/7 nemocných pozitivní, u 1/7 vstupně pozitivní a u 4/7 nemocných negativní. Kožní test Id-proteinem byl pozitivní u 3/11 nemocných, negativní u 3/11 a 5/11 nemocných mělo vytvořenou imunologickou paměť na Id-protein již před zahájením vakcinací. Přes pozorovanou imunologickou reakci na vakcínu nebyla pozorována klinická odpověď. Výsledky byly srovnávány s kontrolní skupinou nemocných. Mezi oběma skupinami nebyly ve vývoji nemoci statisticky významné rozdíly, ale pozorovali jsme trend k delší stabilizaci nemoci u vakcinovaných pacientů a numericky více nemocných zůstalo ve stabilní fázi onemocnění a nevyžadovalo léčbu. Závěr: S využitím nově optimalizovaného neradioaktivního cytotoxického testu jsme prokázali, že v in vitro podmínkách vytvořené potenciálně cytotoxické T lymfocyty vykazují specifický cytotoxický efekt. V in vivo podmínkách jsme vyzkoušeli bezpečnost a účinnost dvou typů protinádorových vakcín. V obou případech byl použit jako antigen autologní Id-protein. Obě vakcíny se ukázaly bezpečné. Ač nebyla pozorovaná klinická odpověď, byla v obou případech zjištěna reakce imunitního systému na podanou vakcínu. Tato pozorování dokazují, že imunitní systém je schopen reagovat na podanou vakcínu, je však zřejmé, že je třeba hledat účinnější antigeny či účinnější cesty stimulace imunitního systému k protinádorové odpovědi.

Abstract:

Introduction: Multiple myeloma (MM) is a hematological malignancy that remains incurable. That is why new ways of treatment are necessary. One of these ways might be using the potential of the patient’s own immune system. In recent years, knowledge about tumor associated antigens, properties, functions and interactions of immunocompetent cells, effect of various cytokines is increasing – therefore new types of potentially effective anticancer vaccines are emerged. With the expanding spectrum of possible anticancer vaccines, monitoring of immune system is becoming more and more important. Anticancer effect of specific cytotoxic T lymphocytes is considered to be crucial so in vitro testing of their cytotoxic potential is necessary. Aims: The aim of this study was to evaluate immunological potential of organism in the fight against cancer cells in in vitro and in vivo conditions in MM patients. One of the aims was to set up cytotoxic test to evaluate cytolytic activity of specific cytotoxic T lymphocytes and test specificity and cytotoxic effect of potentially cytotoxic T cells in allogeneic and autologous conditions using malignant myeloma cells. Another aim was to evaluate quality, safety and clinical and immunological effect of administration of two types of anticancer vaccines in MM patients. Methods and results: 1. Non-radioctive cytotoxic test for testing cytotoxic potential of specific cytotoxic T cells against cancer cells was optimized. Population of cancer cells was differentiated from T lymphocytes ¨ (effector cells) using CFSE staining of T lymphocytes. Concentration of CFSE that allows for differentiation of these two populations was set at 1uM. The optimal ratio of effector : cancer cells was set at 10:1; optimal time of cultivation in mixed lymphocyte reaction was 24 hrs. Dead cells were differentiated by PI or 7-AAD staining; test was evaluated by flow cytometry. 2. Optimized cytotoxic test was used to evaluate the effect of in vitro prepared potentially cytotoxic T cells in allogeneic conditions using ARH77 cell line and T cells from healthy donors obtained from buffy coat. Potentially cytotoxic T cells were identified as INF-γ positive fraction after stimulation by tumor antigen (apoptotic bodies of ARH 77 cell line). It was proved that specific cytotoxic T cells show larger cytotoxic potential against cells of the ARH77 cell line in comparison to effect against allogeneic mononuclear cells (MNC) or in comparison to the effect of INF-γ negative fraction of T cells against ARH77 cells. 3. Next, the same analysis was used for testing cytotoxicity of T cells in autologous conditions using tumor myeloma cells obtained from bone marrow aspirates of patients with MM and T cells obtained from peripheral blood of the same patients. Specific T cells were prepared after stimulation with autologous dendritic cells (DC) loaded with apoptotic bodies of autologous myeloma cells. Cytotoxic potential of specific T cells against malignant myeloma cells was proven; T cells showed cytotoxic effect against cells of the ARH77 myeloma cell line as well. On the other hand, specific cytotoxic T cells showed minimal cytotoxic potential against allogeneic MNC. 4. In clinical study phase I/II, 12 MM patients were treated with first anticancer vaccine in the Czech Republic approved by SUKL (State institute for drug control). Vaccine was based on i.d. administration of autologous purified Id-protein together with immunogen KLH and IL-2. Six vaccines in monthly intervals were given. No side effects were noted except for slight dermal reaction in the location of administration. Immunological reaction was tested by ELISpot, proliferation thymidine test and skin DTH test. ELISpot and thymidine test was positive in 2/12 patients, skin test was positive in 7/7 of evaluated patients; out of these, 4 had a stronger reaction to Id protein than to KLH. Clinical response to vaccine was not observed. These results are similar to results of clini

Abstract:

cal studies carried out at international centers. 5. The second vaccine tested in clinical study phase II was composed of autologous DC loaded with autologous Id-protein. Vaccine was given to 11 MM patients intradermally, 6 times in monthly intervals. Similarly to the previous vaccine, no side effects were observed with the exception of local response in the area of injection. Immunological response by ELIspot was positive in 1/7 patients, in 1/7 the immunological reaction to Id-protein was found before the vaccination and in 4/7 patients was negative. Skin test by Id protein was positive for 3/11 patients, negative for 3/11, and 5/11 patients had immunological memory to Id protein before treatment was started. Even though we observed immunological reaction to vaccine, no clinical response was observed. Results were compared to control group of patients. There were no statistically significant differences between these two groups in disease progression but a trend to longer stabilization of disease in vaccinated patients was noted; numerically, more patients remained in stable phase of disease and did not require any treatment. Conclusion: Using newly optimized nonradioactive cytotoxic test, we proved that in vitro prepared potentially cytotoxic T cells are indeed specifically cytotoxic. In in vivo conditions, we tested the safety and efficiency of two types of tumor vaccines. Both vaccines were safe. Although no clinical response was observed, we noted response of the immune system for both vaccines. These conditions prove that the immune system is capable of reacting to the vaccine but at the same time it is obvious that it is necessary to look for more effective antigens or efficient ways of stimulating the immune system to anticancer response.

Keywords

ultiple myeloma, Id-protein, dendritic cells, cytotoxicity test

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 24. 1. 2011

Thesis defence

• Date of defence: 31. 3. 2011
• Supervisor: prof. MUDr. Roman Hájek, CSc.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Oncology (4-years) / Oncology