Charakterizace mutantních forem 17beta-HSD10 proteinu.

Kateřina Vašová

Diplomová práce

Characterisation of 17beta-HSD10 protein mutant forms.

Anotace:

Mitochondriální enzym 17β-hydroxysteroid dehydrogenáza typu 10 (17β-HSD10), jehož kofaktorem je NAD+/NADH (nikotinamidadenindinukleotid, resp. jeho redukovaná forma), je lokalizován uvnitř mitochondriální matrix. 17β-HSD10 je multifunkčním katalyzátorem redukcí aldehydů a ketonů a oxidací alkoholů. Jeho enzymatická aktivita je důležitá pro správné fungování neuronů. Enzym má široké spektrum substrátů, nejdůležitějšími substráty jsou androgeny a estrogeny, kofaktorem při enzymových reakcích je NAD+. 17β-HSD10 je vazebným partnerem pro peptid amyloid-beta. Patologie spojená s amyloidem-beta je následkem jeho akumulace, tvorby fibril a amyloidních plaků. Právě tyto procesy v mozku úzce souvisí se vznikem Alzheimerovy choroby. Experimentální část této diplomové práce byla zaměřena na přípravu enzymu 17β-HSD10 a jeho dvou mutantních forem 17β-HSD10 (Y168G, K172G) a 17β-HSD10 (S98A, K99A, T100A, Y101A). Exprese proteinu probíhala v bakteriálním expresním systému E. coli BL21 (DE3) nesoucím plazmid pET28b s rekombinantně vloženými geny. Z buněk expresního systému byl enzym purifikován, pomocí SDS-PAGE byla ověřena velikost a čistota purifikovaného proteinu, Bradfordovou linearizovanou metodou byla stanovena koncentrace proteinu. Byla změřena enzymatická aktivita proteinu 17β-HSD10 a jeho dvou mutantních forem, jako substrát byl použit 17β-estradiol, kofaktorem této reakce byl NAD+. Pro aktivní formu enzymu byly experimentálně stanoveny parametry a KM a Vmax.

Abstract:

The mitochondrial enzyme 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 10 (17β-HSD10), with the cofactor NAD+ / NADH (nicotinamide adenine dinucleotide or its reduced form) located inside the mitochondrial matrix. 17β-HSD10 is a multifunctional catalyst for the reduction of aldehydes and ketones and also the oxidation of alcohols. Its enzymatic activity is important for the proper functioning of neurons. The enzyme has a wide range of substrates, the most important substrates are androgens and estrogens. The cofactor in enzymatic reactions is NAD +. 17β-HSD10 and it is able to bind amyloid-beta peptide. The accumulation of amyloid-beta and the formation of fibrils and amyloid plaques in the brain are closely related to the development of Alzheimer's disease.The experimental part of this diploma thesis is focused on the preparation of the enzyme 17β-HSD10 and its two mutant forms 17β-HSD10 (Y168G, K172G) and 17β-HSD10 (S98A, K99A, T100A, Y101A). The protein is expressed in the bacterial expression system E. coli BL21 (DE3) carrying the plasmid pET28b with recombinantly inserted genes. The enzyme is purified from the expression system. The size of the purified protein was verified by SDS-PAGE electrophoresis, and the protein concentration was determined by the Bradford linearized method. The enzymatic activity of the 17β-HSD10 protein and its two mutant forms was measured, 17β-estradiol was used as a substrate, and NAD+ was the cofactor of this reaction. The parameters and KM and Vmax were experimentally determined for the active form of the enzyme.

Klíčová slova

17β-HSD10, Alzheimerova choroba, amyloid – beta, purifikace proteinu, enzymatická aktivita

Keywords

17β-HSD10, Alzheimer's disease, amyloid – beta, protein purification, enzymatic activity

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 1. 1. 2023

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 25. 1. 2023
• Vedoucí: Mgr. Monika Schmidt, Ph.D.
• Oponent: Mgr. Ing. Miloslava Bajer Ďuráčová, Ph.D.

Univerzita Hradec Králové

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie a ekologie / Experimentální biologie