Isocitrát dehydrogenáza u difúzních gliomů: mutační analýza genů IDH1/2 pomocí sekvenování nové generace (NGS)

Bc. Kateřina Zettlová

Master's thesis

Isocitrate dehydrogenase in diffuse gliomas: mutational analysis of IDH1/2 genes by Next-Generation Sequencing (NGS)

Abstract:

Isocitrát dehydrogenáza (IDH) je enzym, který hraje klíčovou roli v řadě biologických procesů, včetně Krebsova cyklu, metabolismu či buněčné homeostázy. Missense mutace v kodonu 132 genu IDH1 a 172 genu IDH2 (genů kódujících cytoplazmatické a mitochondriální formy enzymů – IDH1 a IDH2) jsou spojovány s procesem gliomageneze. Gliomy jsou nejčastějšími primárními nádory centrálního nervového systému (CNS) tvořící ~80 % všech malignit mozku. Představují heterogenní skupinu nádorů vykazující různé morfologické a genetické znaky spojené s velmi variabilní odpovědí na terapii. Přesná diagnostika a klasifikace nádoru je klíčová pro volbu vhodné terapie. V roce 2016 byla standardní histopatologická klasifikace rozšířena o molekulární diagnostiku a mutační stav IDH1/2 se stal ústředním diagnostickým markerem difúzních gliomů. Dle doporučení WHO CNS 2021 by u pacientů mladších 55 let s difúzním gliomem měla být po předchozím negativním výsledku imunohistochemického vyšetření (verifikaci nepřítomnosti mutantního proteinu IDH132H pomocí specifické protilátky) provedena sekvenace genů IDH1/2 s cílem odhalit vzácné nekanonické mutace IDH1/2. V rámci diplomové práce (v Laboratoři molekulární a genetické diagnostiky Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně) bylo provedeno hodnocení mutačního stavu IDH1/2 pomocí sekvenování nové generace (NGS) u 21 pacientů s difúzním gliomem mladších 55 let. Výsledky byly srovnány s další nezávislou metodou, qPCR. Real-Time PCR byla dále využita k verifikaci výsledků získaných metodou IHC u vzorků, u kterých se dle současných doporučení ověření molekulárně-genetickou metodou standardně neprovádí (tj. IDH1 R132H pozitivních vzorků, IDH1 R132H negativních vzorků pacientů starších 55 let). Shoda výsledků mezi IHC a NGS byla zaznamenána v 76 % (16/21) případů. U 24 % (5/21) případů byla pomocí NGS prokázána klinická falešná negativita IHC. Byly prokázány nekanonické mutace IDH1/2 – IDH1 R132G (3; 14 %) s VAF 1.36, 37.46, 1.48 a IDH1 R132L (2; 9,5 %) s VAF 1.28 a 1.45. Metoda qPCR nedokázala detekovat mutace s nízkým VAF. Mutace IDH1 R132H byla v qPCR testu prokázána ve 100 % (7/7) případů (zkřížená reaktivita protilátky neprokázána). V ~43 % (3/7) se však objevila zkřížená reaktivita PCR testu (dvojitá pozitivita s IDH1 R132C). Shoda výsledků mezi IHC (IDH negativní vzorky) a PCR dosahovala 100 %. Výsledky potvrdily důležitost verifikace IHC negativních výsledků pomocí genetického sekvenování, vhodnost IHC jako primární screeningové metody pro detekci kanonické mutace IDH1 R132H a celkově podtrhly klinický přínos NGS (především pak u vzorků s nízkým zastoupením nádorových buněk v diagnostikované tkáni) v porovnání s méně citlivými metodami detekce.

Abstract:

Isocitrate dehydrogenase (IDH) is an essential enzyme that participates in several major biological processes, including the Krebs cycle, metabolism, and cellular redox homeostasis. Missense mutations in codon 132 of the IDH1 gene and 172 of the IDH2 gene (genes encoding cytoplasmic and mitochondrial forms of enzymes – IDH1 and IDH2) are associated with the process of gliomagenesis. Gliomas are the most common primary tumors of the central nervous system (CNS) accounting for ~80% of all malignant primary brain tumors in adults. Diffuse gliomas represent a heterogeneous group that varies greatly in morphology, location, genetic alterations, and response to therapy. Accurate diagnosis and classification of the tumor are crucial for selecting an appropriate treatment strategy. In 2016, for the first time, the World Health Organization used molecular parameters in addition to histology to define CNS tumors, IDH1/2 mutational status has become a central diagnostic marker of diffuse gliomas. According to the 2016 WHO central nervous system tumor classification, assessment of IDH mutation status by DNA sequencing is recommended for all patients below 55 years with diffuse glioma after a previous negative result of immunohistochemical detection (verification of the absence of the mutant IDH132H protein using a specific antibody) with the aim of detecting rare non-canonical IDH1/2 mutations. As part of the diploma thesis, the mutation status of IDH1/2 was evaluated using next-generation sequencing (NGS) in 21 FFPE samples, patients of the St. Anne´s University Hospital Brno with diffuse glioma below 55 years. The results were compared with another independent method, qPCR. Real-Time PCR was further used to verify the results obtained by the immunohistochemical detection of IDH in samples for which, according to current recommendations, verification by molecular genetic method is not performed as a standard (IDH1 R132H positive, IDH1 R132H negative samples from patients older than 55 years old). Concordance of findings between IHC and DNA sequencing was noted in 76% (16/20). In 24% (5/21) cases, immunohistochemistry was clinically false negative. By using NGS, following non-canonical IDH1/2 mutations were discovered – IDH1 R132G (3; 14%) with VAF 1.36, 37.46, 1.48 and IDH1 R132L (2; 9.5%) with VAF 1.28 and 1.45. By using qPCR mutations with low VAF values were undetectable. The results of PCR tests were in 100 % agreement (7/7) with results of IHC detection of IDH1 R132H in with no cross-reactivity of antibodies detected. However, PCR assay cross-reactivity (double positivity with IDH1 R132C) occurred in ~43% (3/7) of cases. The agreement of results between IHC (IDH negative samples) and PCR reached 100%. These results supported the importance of verification of IHC negative results by using genetic sequencing, the optimal choice of the IHC as a primary screening method for the detection of the most common IDH1 R132H mutation, and overall underlined the clinical benefit of NGS compared to less sensitive detection methods with limited sequence resolution.

Keywords

IDH, NGS, sekvenování, difúzní gliomy, glioblastom, astrocytom, oligodendrogliom, WHO CNS 2021, Real-Time PCR, IHC, GENOVESA, MiSeq Illumina, Next-Generation Sequencing, diffuse gliomas, glioblastoma, astrocytoma, oligodendroglioma

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 5. 2024

Thesis defence

• Date of defence: 18. 6. 2024
• Supervisor: Mgr. Milada Dvořáčková, Ph.D.
• Reader: Mgr. Zbyněk Čech

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Bioanalytical Laboratory Diagnostics in Medicine - Bioanalytic / Bioanalytical Laboratory Diagnostics in Medicine - Bioanalyst