Mutageneze rekombinantního proteinu L19R

Mgr. Eva Hasíková

Bachelor's thesis

Mutagenesis of recombinant gene L19R

Anotácia:

Elicitiny reprezentují proteinové elicitory v interakci rostlina – patogen. Jsou schopné vázat steroly a vyšší mastné kyseliny. Kryptogein je 10 kDa protein vylučovaný oomycetou Phytophtora cryptogea, který způsobuje u rostlin tabáku silnou obranou reakci a může vést až k nekróze listů. U mutantní formy kryptogeinu L19R je aminokyselina leucin nahrazena argininem. Hlavním cílem práce bylo provést mutaci L19R u genu X24 pomocí metody cílené mutageneze využívající PCR. Vzniklý vektor nesoucí mutovaný gen X24 byl naklonován do buněk E. coli za účelem pomnožení. Vektor byl následně izolován, linearizován a transformován do methylotrofní kvasinky Pichia pastoris. Úspěšní transformanti byli analyzovány pomocí SDS elektroforézy na schopnost produkovat daný protein. Konečným výsledkem je 8 klonů schopných produkovat mutantní formu kryptogeinu L19R. Vytvořená mutantní forma L19R bude využita v budoucích pokusech.

Abstract:

Elicitins represent proteins elicitors in the plant-pathogen interactions. They are known to bind sterols and fatty acids. Cryptogein is 10 kDa elicitin secreted by oomycetes Phytophthora cryptogea, which induces strong defense reaction leading even to leaf necrosis in tobacco plants. L19R is a type of mutant cryptogein, where arginin is located instead of leucin. The main goal of this work was to realize mutation of L19R within the gene for cryptogein X24 through the use of site-directed mutagenesis based on PCR method. Mutant L19R was cloned into vector pPIC9, which was integrated into E. coli to be multiplied. Vector was isolated, linearized and transformed to methylotrophic yeast Pichia pastoris. Successful clones were analyzed by SDS electrophoresis for their ability to produce desired protein. Final result is 8 clones able to produce mutant protein L19R. Mutant will be used in future experimental studies.

Keywords

mutagenesis, cryptogein L19R, Pichia pastoris

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 15. 5. 2009

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 15. 6. 2009
• Vedúci: doc. Mgr. Jan Lochman, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / odbor:
Biochemistry / Biochemistry