Komplexní analýza genomů jedinečných bakteriofágů a plazmidů nesoucích geny pro exfoliativní toxiny A a B u Staphylococcus aureus

Mgr. Tibor Botka, Ph.D.

Doctoral thesis

Complex genome analysis of unique converting bacteriophages and plasmids carrying genes for exfoliative toxin A and B in Staphylococcus aureus

Anotácia:

Staphylococcus aureus je významný oportunní patogen a častý původce bakteriálních nozokomiálních nákaz. Vznik patogenních kmenů je umožněn zejména horizontálním přenosem genů pro faktory virulence prostřednictvím mírných bakteriofágů a plazmidů. Takto jsou přenášeny i geny pro exfoliativní toxiny A (ETA) a B (ETB), které způsobují epidermolytická onemocnění zejména novorozenců a dětí předškolního věku. Mírná lokální forma se nazývá bulózní impetigo, zatímco generalizovaný a život ohrožující stav se označuje jako stafylokokový syndrom opařené kůže (SSSS – Staphylococcal scalded skin syndrome). Předmětem dizertační práce je molekulární charakteristika a komparativní analýza genomů dosud nepopsaných eta-pozitivních bakteriofágů čeledi Siphoviridae (ETA fágy) a etb-pozitivních plazmidů (ETB plazmidy), které byly izolovány z kmenů S. aureus zodpovědných za epidermolytická onemocnění v ČR. Kmeny obsahující studované ETA profágy a ETB plazmidy byly vybrány na základě etiologie, klinického zdroje a genotypizace. DNA izolovaných fágů a plazmidů byla osekvenována a anotována. Analýza genomů ETA fágů odhalila četné rozdíly v sekvencích, které se projevily například ve strukturních proteinech virionů. Bylo identifikováno i několik oblastí získaných zřejmě rekombinačními procesy. Oba zkoumané bakteriofágy představují dosud nepopsané typy fágů náležejících do čeledi Siphoviridae. S jejich použitím byla provedena pozitivní lyzogenní konverze netoxinogenního kmene S. aureus na vysoce efektivního producenta ETA, což potvrdilo významnou roli ETA fágů v patogenitě hostitelské bakterie. Studiem ETB plazmidů bylo zjištěno, že plazmidy izolované z kmenů S. aureus klonálního komplexu CC121 sdílí rozsáhlou oblast sekvence DNA, která zahrnuje typické geny virulence, tj. gen pro ETB a EDIN C. Plazmidy této linie však obsahují také variabilní úseky umožňující jejich rozlišení. Přestože se dosud předpokládalo, že ETB plazmidy jsou relativně uniformní, byl v této práci překvapivě izolován a popsán dosud neznámý typ vykazující minimální sekvenční homologii s ostatními ETB plazmidy. Protože nese geny pro konjugaci a nové varianty genů pro faktory virulence včetně etb, reprezentuje tak zcela novou linii ETB plazmidů. V této práci byla navržena multiplex PCR pro spolehlivou identifikaci všech typů ETB plazmidů. Třetí část práce se zabývala PCR genotypizací kmenů S. aureus izolovaných z 92 českých pacientů s cystickou fibrózou. Zatímco geny pro enterotoxiny obsahovala více než polovina kmenů, gen pro ETA byl identifikován jen u dvou z nich. Gen pro ETB nebyl zjištěn u žádného kmene. Výsledky tak odpovídaly dříve publikované nízké prevalenci kmenů, které jsou schopny produkovat exfoliativní toxiny.

Abstract:

Staphylococcus aureus is an important opportunistic pathogen and common cause of bacterial nosocomial infections. A horizontal gene transfer of virulence factors, promoted by tempered bacteriophages and plasmids, plays a crucial role in mechanism of pathogenic strains origin. Exfoliative toxins A (ETA) and B (ETB), transferred by this way, are the cause of epidermolytic diseases mostly of newborns and young children. The mild localized form is called bullous impetigo, while the generalized life-threatening condition is known as staphylococcal scalded skin syndrome (SSSS). This dissertation is focused on molecular characterization and comparative genomic analysis of previously undescribed staphylococcal eta-positive bacteriophages of the family Siphoviridae (ETA phages) and etb-positive plasmids (ETB plasmids) isolated from S. aureus strains implicated in epidermolytic diseases in Czech Republic. The strains containing studied ETA phages and ETB plasmids were chosen on the base of etiology, clinical source and genotyping. The DNA of isolated phages and plasmids was sequenced and annotated. Analysis of the ETA phage genomes revealed numerous differences that manifested, for example, in virion structural proteins. Several parts gained probably by recombination were identified. So, both the phages represent novel and up to now undescribed types of phages belonging to Siphoviridae family. Using them, we accomplished positive lysogenic conversion of non-toxigenic S. aureus strain to highly effective producer of ETA. This confirmed an important impact of ETA phages on the host strain pathogenicity. The analysis of ETB plasmids showed, that plasmids isolated from S. aureus strains of clonal complex CC121 share a large part of DNA sequence including typical virulence genes, i.e. genes for ETB and EDIN C. However, plasmids of this lineage contain also variable regions facilitating their differentiation. Although ETB plasmids have been assumed to be relatively uniform, we unexpectedly isolated and described a novel yet unknown type showing minimal sequence homology with other ETB plasmids. Moreover, it carries genes for conjugation and novel variants of virulence genes including etb. Therefore, it represents a novel lineage of ETB plasmids. A valuable multiplex PCR assay has been designed to distinguish all the types of ETB plasmids. The last part of this thesis is focused on gene typing of S. aureus strains isolated from 92 Czech patients suffered for cystic fibrosis. While more than half of isolates was enterotoxin genes-positive, only two of them contain eta gene. No etb gene-positive isolate was detected. These results correspond to previously published low prevalence of exfoliative toxin-producing strains.

Kľúčové slová

ETA bakteriofág, ETB plazmid, exfoliativní toxin, gen eta, gen etb, Staphylococcus aureus, genomová analýza, proteomická analýza, lyzogenní konverze, diferenciace, fylogeneze ETA bacteriophage, ETB plasmid, exfoliative toxin, eta gene, etb gene, genomic analysis, proteomic analysis, lysogenic conversion, differentiation, phylogeny

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 22. 6. 2017

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 20. 10. 2017
• Vedúci: doc. RNDr. Vladislava Růžičková, CSc.
• Oponent: prof. MUDr. David Šmajs, Ph.D., doc. MVDr. Renáta Karpíšková, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Biology (4-years) / Molecular and Cellular Biology