Návrh a testování způsobů zvýšení účinnosti transfekce živočišných buněk

Bc. Hana Štěpánková

Master's thesis

Design and testing of methods of increasing the transfection efficiency in mammalian cells

Anotácia:

Diplomová práce se zabývá návrhem a testováním způsobů zvýšení účinnosti transfekce živočišných buněk. V práci byla jako výchozí metoda využita transfekce pomocí polyethyleniminu (PEI). Účinnost transfekce byla testována na buněčné kultuře prsních nádorových buněk MDA-MD-231 pomocí vektoru pcDNA3.1-GFP-hMT-TOPO. Optimalizována byla koncentrace PEI (1-6 µg) a plazmidové DNA (pDNA, 1-3 µg), dále čas transfekce (0-48 hod), počet buněk na 9 cm2 (100 000 - 2 miliony) a složení média. Pro zvýšení účinnosti transfekce byl připraven komplex s lineárními penetrační peptidy (CPPs) KALA a GALA. Optimalizována byla také koncentrace CPPs (7,5-45 µg). U výsledných komplexů byl analyzován zeta potenciál a velikost. Kvůli tvorbě velkých agregátů (přes 1200 nm) se prováděla modifikace PEI polyethylenglykolem (PEGylace). Se vzniklým komplexem (~15 nm) byla provedena transfekce. U komplexů obsahující PEI a u komplexů obsahující PEGylovaný PEI se zhodnotila účinnost transfekce a apoptóza. Jako nejvhodnější komplex byl identifikován PEGylovaný PEI (3 µg) s 45 µg GALA a 3 µg pDNA, který dosahoval transfekční účinnosti až 75%.

Abstract:

Master’s thesis deals with the design and testing of methods of increasing the transfection efficiency in mammalian cells. In this work a polyethylenimine (PEI) transfection method was used. The transfection efficiency was tested using MDA-MB-231 breast cancer cell line and pcDNA3.1-GFP-hMT-TOPO vector. We focused on optimization of PEI (1-6 µg) and plasmid DNA (1-3 µg) concentration, transfection time (0-48 h), number of cells per 9 cm2 (100,000-2 million) and medium composition. A complex containing linear penetration peptides (CPPs) KALA and GALA was assembled. Concentration of CPPs (7,5-45 µg) was optimized and a zeta potential and a size of the complexes were investigated. Due to the formation of large aggregates (over 1200 nm), modification with polyethyleneglycol (PEGylation) of PEI was performed. With the resulting complexes (~15 nm), transfection was performed. Transfection and apoptosis induction rates were compared between PEI and PEGylated PEI and as the best was chosen conjugate of PEGylated PEI (3 µg) with 45 µg of GALA and 3 µg pDNA with efficiency of 75%.

Kľúčové slová

buněčná linie, lineární penetrační peptidy, polyethylenimin, vektor

Keywords

cell line, linear penetration peptides, polyethyleneimine, vector

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 26. 4. 2018

Obhajoba závěrečné práce

• Vedúci: Mgr. Zbyněk Heger, Ph.D.

Mendel University in Brno

Faculty of AgriSciences

Master programme / odbor:
Animal Breeding / Animal Biotechnology